弓形虫疫苗及其保护性研究现状

本文对近年来研制的弓形虫疫苗的种类、方法及其免疫保护性进行了综述，以期为弓形虫疫苗的进一步研究提供参考。     

苯丙酮尿症的研究进展

苯丙酮尿症是新生儿必须筛查的疾病之一。该病是否及时诊断和治疗关系到苯丙酮尿症患者的生命质量。随着分子生物学的发展，苯丙酮尿症成为一个新的研究方向。从病因与发病机制、临床表现、实验室检查和治疗等多方面阐述了苯丙酮尿症的研究状况和进展。     

重组Calpain蛋白诱导抗体产生及检测日本血吸虫感染的研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫病诊断上的应用。方 法用重组Calpain蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)产生特征；同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原，粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗，肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清。结果 重组Calpain抗原免疫小鼠后，产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体，免疫4周IgG类抗体达到高峰，与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1，IgG2a，IgG2b特异性抗体也显著上升；Calpain重组抗原血清检测日本血吸虫和粪检的符合率为100％，粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高，EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低，与肝吸虫的交叉反应率为37％。结论 日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，能够敏感地测定日本血吸虫的感染，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒S蛋白部分序列1的纯化及免疫活性分析

目的表达和纯化严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒S蛋白部分序列1（S1）,分析其诱导的免疫应答.方法大量诱导表达SARS冠状病毒S1蛋白,经超声裂解细菌后,取上清液进行亲和层析以纯化S1蛋白,并冻干浓缩;用纯化的S1蛋白免疫小鼠3次,间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测产生的抗体IgG及其亚类的滴度,分析S1蛋白诱导的免疫应答.结果表达的S1蛋白主要存在于包涵体中,裂解上清液中存在少量S1蛋白;亲和层析纯化获得了能被SARS患者混合血清识别的S1蛋白,融合蛋白免疫小鼠3次后诱导产生了高滴度的IgG抗体和Th1/Th2型的免疫应答.结论纯化的S1蛋白具有良好的免疫学活性.     

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究

目的用pVACGRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用。方法大量制备pVACGRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照。于末次免疫4周后作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFNγ及IL4含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),并观察攻毒试验后小鼠存活情况。结果脾淋巴细胞增殖各组间差异无显著性(P>0.05);pVACGRA4组CD4+T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫组IFNγA值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4组可诱导产生特异性IgG抗体,但滴度不高;pVACGRA4免疫组小鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论用pVACGRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫攻击感染的部分保护作用。     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

间日疟原虫MSP1 C端编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆间日疟原虫MSPl C端编码基因，并进行序列测定和分析。方法 根据间日疟原虫MSPl C端编码基因设计1对引物，采用PCR技术从深圳间日疟患者血样(编号为PvSZl)的核酸提取物中扩增出MSPl C端编码基因，回收纯化后，与T载体连接构建重组子pMD／MSPl，并转化大肠杆菌JMl09。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后，双脱氧链末端终止法双向测定序列并分析。结果 从间日疟血样提取的DNA中扩增出1119bp的基因片段，所构建的pMD／MSPl阳性克隆重组子经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的间日疟原虫PvSZl C端基因序列与国外Sal-1株比较，碱基数相同，未发现碱基缺失，相同的核苷酸占96．7％，序列中第542位碱基变化为同义突变(GTC→GTT，均编码缬氨酸)，第375～542区间的碱基变化数占整个序列变化碱基总数的92．9％(34／37)。所推测的氨基酸序列与Sal-1株比较，同源性为92．5％。结论 成功克隆了间日疟原虫PvSZl株MSP1 C端编码基因，该基因存不同间日疟原虫地弹株间相对保守，所克隆基因序列的第375～542核苷酸区域为高频变化区。     

疟原虫DNA模板制备用于PCR诊断方法的研究

为确立一种快速，敏感，特异的疟原虫检测方法，根据红内期疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因序列，设计合成引物３条，采用微量全血和滤纸干血滴标本快速制备疟原虫ＤＮＡ模板的９种方法，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）并比较。结果显示有５种方法的实验效果最佳，其中，全血ＰＣＲ仪预热及滤氏干血滴Ｃｈｅｌｅｘ煮沸两法操作简单，所需试剂较少。采用该两法对深圳地区２０２份和湖北地区１６份镜检阳性的全血和深圳地区１２９份滤纸干血滴标     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。