稻曲病菌Six1类效应蛋白UvSix1-1的功能研究

 稻曲病菌在侵染过程中会分泌大量的效应蛋白来帮助其侵染。本研究鉴定到一个稻曲病菌效应蛋白UvSix1-1,同源序列比对及系统发育分析发现其具有Six1蛋白保守的氨基酸位点,并与多个病原菌中的Six1蛋白具有同源性。进一步研究发现UvSix1-1可以抑制Bax、XEG1和INF1引起的烟草叶片细胞坏死,并且其预测的信号肽区域具有分泌功能,在烟草上瞬时表达UvSix1-1可以促进辣椒疫霉的定殖。对不同稻曲菌株中的序列进行分析,没有发现序列多态性,说明该基因非常保守。以上研究结果表明,UvSix1-1在病原菌侵染过程中发挥作用,研究结果为稻曲病菌效应蛋白的研究提供参考。     

心叶烟NPR1基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

 NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)基因在拟南芥系统获得抗性中起着关键作用,可调控拟南芥植株广谱抗性的发生。本文报道了从心叶烟中克隆NPR1同源基因(NgNPR1)及其表达特性的研究结果。NgNPR1 cDNA全长2253 bp,编码588个氨基酸。将NgNPR1基因组全长与cDNA序列进行比对发现,NgNPR1基因组DNA含有4个外显子和3个内含子。Southern杂交分析表明,在心叶烟基因组中NgNPR1为单拷贝基因。采用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的试验,证明了NgNPR1蛋白在水杨酸诱导时会从细胞质转运到细胞核中。Northern杂交分析发现,NgNPR1基因可以被与植物抗病相关的信号分子如水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢和乙烯所诱导。进一步研究发现,植物病原物如赤星病菌、青枯病菌和烟草花叶病毒对心叶烟植株的侵染也会使NgNPR1表达量增加。这些结果表明,NgNPR1基因在心叶烟植株抵御病原物侵染过程中可能起着重要作用。     

稻曲菌交配型初探

 稻曲菌（有性态：Villosiclava virens;无性态：Ustilaginoidea virens）有性繁殖产生的子囊孢子是水稻稻曲病可能的初侵染源之一,交配型基因座对真菌有性繁殖中的性别控制起着决定性作用。为进一步揭示稻曲菌的有性繁殖方式,本研究首次克隆了稻曲菌交配型基因mat1-1-1的α-结构域（α-domain）相应核苷酸序列,发现其与麦角菌科真菌Cordyceps militaris、Cor. bassiana和Claviceps purpurea的mat1-1-1基因中α-结构域相应核苷酸序列同源性分别为61%、63%和68%;根据mat1-1-1和mat1-2-1部分基因序列设计特异性引物,并使用PCR方法检测了来源于3个异源子座的240个子囊孢子单孢菌株和50个田间菌株的交配型基因,结果显示稻曲菌mat1-1-1和mat1-2-1基因分别存在于不同菌株中;将具有相同或不同交配型基因的菌株配对接种,发现菌核通常产生在mat1-1-1和mat1-2-1基因型菌株配对接种产生的稻曲球上,其中大部分菌核可萌发产生子座,而菌株单独接种或具有相同交配型基因的菌株配对接种水稻后多数不能形成菌核;根据以上结果初步推断稻曲菌为异宗配合真菌。     

稻曲病菌有性生殖中光诱导基因的转录组分析

 稻曲病菌(Villosiclava virens)能够以菌核的形式安全越冬并在来年萌发产生子囊孢子,成为稻曲病菌的重要初侵染源;而菌核产生子实体的过程需要光的诱导。为了探索光诱导的分子机制,本文对不同光照处理条件下稻曲病菌菌核萌发过程的转录组学进行了比较分析。结果发现,与黑暗条件下菌核的萌发相比,光照处理后542个基因显著差异表达,其中上调359个,下调183个。GO富集分析发现,DEGs显著富集于糖基水解酶活性、细胞壁生物合成、氧化还原酶活性等。KEGG分析发现,DEGs显著富集于脂质代谢、氨基酸代谢、次生代谢产物合成等代谢通路。DEGs中子实体独有基因组氨酸激酶为光感受器,其响应光信号引起下游基因的表达,同时,与有性生殖过程相关的水通道蛋白和甲基转移酶蛋白编码基因表达活跃,共同调控了菌核萌发产生子实体过程。     

菊花‘C029’转录因子基因CmWRKY15-1的抗病功能分析

 菊花白色锈病(chrysanthemum white rust,CWR)是影响菊花生产效益的重要病害,明确菊花高抗品种‘C029’的抗病基因CmWRKY15-1响应菊花白色锈病的分子机制,对于培育菊花抗病新品种具有重要的理论和现实意义。本研究以菊花高抗品种‘C029’为试验材料,构建沉默载体pTRV2-CmWRKY15-1与过表达载体pBI121-CmWRKY15-1,利用农杆菌介导法转化菊花‘C029’,分别获得8株沉默株系,表达效率约为正常水平的30%～60%,和3株过表达株系,其中一株的表达水平为野生型(WT)的3.4倍,命名为OE-1。在病原菌侵染条件下,qRT-PCR测定WT与转基因株系中病程相关基因的表达量,探究CmWRKY15-1在菊花抵抗白色锈病过程中的功能。病原菌侵染后,在WT与OE-1中,NPR1和PR5的表达水平呈先上升后下降趋势,其表达量在OE-1中早于WT(分别在24和38 h)达到最高峰,PR1的表达量在OE-1于38 h达到峰值。在沉默株系中,NPR1和PR5的表达则受到抑制,且一直低于WT与OE-1株系。结果表明:CmWRKY15-1通过调控病程相关基因参与菊花抵抗白色锈病的反应。综上,CmWRKY15-1对菊花‘C029’抗白色锈病起到调控作用。     

小麦白粉病菌有性生殖与自然群体交配型检测

 本研究根据MAT1-1-1(GenBank登录号HQ171902)和MAT1-2-1(GenBank登录号HQ171899)的部分基因序列设计和筛选其特异性引物,使用PCR方法对2012年度采自四川、陕西、云南、贵州、河南、安徽、江苏、河北、山东和甘肃10个省30个采集地点共516个小麦白粉病菌菌株的交配型基因进行检测。结果显示30个采集地点两种交配型基因都能检测到,其中28个采集地的两种交配型菌株比例(MAT1-1-1 :MAT1-2-1)符合1:1。选择具不同交配型基因的小麦白粉病菌株配对接种,16个随机杂交组合都能产生闭囊壳。对获得的闭囊壳进行子囊孢子释放,均可获得子囊孢子。该研究结果为深入研究有性生殖对小麦白粉病菌株毒性多样性的作用奠定了基础。     

稻曲病菌bZIP转录因子UvbZIP12的功能研究

 稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)侵染水稻穗部引起的真菌病害,严重影响稻米的产量和品质。bZIP转录因子参与多种植物病原菌的生长发育和致病过程。稻曲病菌中有28个bZIP转录因子,但其具体功能尚未被研究。本研究对bZIP转录因子UvbZIP12在稻曲病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析。稻曲病菌接种水稻后,UvbZIP12基因表达量逐渐升高,在接种后3 d和5 d时具有最高表达量。对UvbZIP12基因的敲除转化子分析发现,敲除转化子ΔUvbZIP12在PSA、PDA、YTD培养基上生长速率显著加快,菌丝干重显著增加;产孢量减少;对NaCl和sorbitol的耐受性增强,对SDS、CR、CFW和H₂O₂的耐受性减弱;对水稻的致病力无明显变化。结果表明,稻曲病菌UvbZIP12参与调控生长发育和对非生物胁迫的耐受性,但不参与致病。     

HarpinXoo诱发烟草过敏反应早期H2O2变化及有关基因表达

 Harpin_Xoo是水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)产生的蛋白类激发子,用harpin_Xoo注射烟草最早在处理后20h出现肉眼可见的细胞死亡(macro-HR),分别经埃文斯蓝(Evans blue)和台盼兰(Trypan blue)染色观察,发现诱导后4-8h即开始有少量细胞死亡,表明在macro-HR发生前烟草细胞已陆续发生微细胞死亡(micro-HR);对二氨基联苯胺(diamino benzidine,DAB)染色显示,在烟草细胞死亡早期,伴有H₂O₂的明显积累;定量RT-PCR法对H₂O₂代谢相关基因的表达进行了分析,发现harpin_Xoo诱导后1h编码NADPH氧化酶的基因rboh即开始表达,3~7h表达较强,10h开始减弱,表达趋势与H₂O₂积累趋势一致;编码交替氧化酶的基因aoxl表达较迟,sodA基因则在诱导后表达减弱。这些基因的不同表达模式说明,它们在harpin_Xoo诱导的H₂O₂代谢过程中可能具有不同的作用。     

苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)果胶裂解酶基因Bdpl1的致病功能分析

 由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的苹果轮纹病是影响我国苹果安全生产的重大病害之一。因此,本研究基于受苹果轮纹菌侵染的苹果组织中果胶裂解酶基因Bdpl1表达上调这一现象,通过Split-marker PCR技术构建Bdpl1基因敲除载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得转化子,经常规PCR和qRT-PCR对所获得的转化子进行筛选,成功获得1个Bdpl1基因缺失阳性突变子。该转化子在PDA上的培养基性状与野生型没有明显差异,但在果胶培养基上菌落直径明显小于野生型。其胞外果胶酶活相比野生型明显下降,但在离体“早富”苹果枝条上的致病力并没有明显的下降。通过qRT-PCR技术发现在基因Bdpl1敲除后,其家族内有3个基因在病菌侵染过程中相比野生型明显上调表达(>3倍)。这些现象表明果胶裂解酶基因Bdpl1与病原菌的营养生长过程关系不大,但其参与对寄主果胶类物质的降解。Bdpl1基因对轮纹病菌致病力的影响较小,有可能是Bdpl1基因敲除后,该基因家族内其他基因的上调表达补偿了Bdpl1基因的功能。     

人工培养基上稻曲病菌拟菌核诱导的初步研究

 稻曲病菌在水稻孕穗期侵染水稻小花,在水稻灌浆后期只在个别稻曲球上形成菌核。因此,稻曲病菌菌核分化与发育基因功能研究的相关试验难度较高。为了探究稻曲病菌在人工培养基上能否形成菌核,本文利用低温或杀菌剂环境对稻曲病菌进行了筛选。结果发现,在81个菌株中有13个在人工培养基上形成拟菌核组织,且它们可在低温处理时稳定地产生拟菌核组织。这些拟菌核组织在结构上与菌核类似,但体积较小且组织较为疏松,无法像菌核一样越冬和完成有性生殖。     

稻曲病菌侵染对水稻小穗发育的影响及H_2O_2的变化趋势

稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起的水稻穗部病害,在全世界不同稻作区均有发生,并在近年呈加重趋势。本研究通过水稻穗期接种后的显微观察及H_2O_2检测,分析了稻曲病菌侵染引起的小穗结构变化及侵染过程中H_2O_2变化趋势。结果表明,稻曲病菌侵染会导致水稻花粉粒畸形、雌蕊发育受抑制、小穗无法正常扬花授粉,抑制谷粒的正常形成,造成稻曲球及白色秕粒的产生。受侵染小穗的H_2O_2含量显著高于对照,其中处于突破颖壳期的受侵染小穗H_2O_2含量是对照的7倍;形成白色秕粒的小穗H_2O_2含量是对照的11倍;二氨基联苯胺染色结果显示,形成稻曲球的小穗中,在受侵染小穗的花药基部、花药顶端、浆片等部位颜色变深,形成H_2O_2富集区;形成白色秕粒的小穗中,H_2O_2富集的特征更为明显,富集区域与病菌在小穗内的侵染途径密切相关。     

核盘菌菌核围微生物群落分析及其对盾壳霉重寄生的影响

 重寄生真菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种生防菌,它通过寄生核盘菌菌核,减少初侵染来源,从而达到防病效果。但在田间自然土壤中,核盘菌菌核围微生物对盾壳霉寄生菌核的影响还不清楚。本研究对核盘菌菌核围微生物进行了分离鉴定,并评估了菌核围细菌对盾壳霉重寄生的影响。结果表明,不同取样时间和不同深度的核盘菌菌核围土壤中,均存在可培养微生物富集的“菌核围效应”,即菌核围土壤中可培养细菌数量和真菌数量均高于非菌核围土壤。从菌核围土壤中共分离获得了253株细菌和180株真菌,并对其中的代表菌株进行了分子鉴定,发现假单胞菌属(Pseudomonas)和芽胞杆菌属(Bacillus)是菌核围细菌的优势种群,青霉属(Penicillium)是菌核围真菌的优势种群。通过平板对峙,从菌核围细菌中筛选到25个菌株对核盘菌有拮抗活性,22个菌株对盾壳霉具有拮抗活性。砂皿寄生菌核试验证实,7株菌核围细菌对盾壳霉寄生菌核有显著的抑制作用。核盘菌菌核围细菌对盾壳霉重寄生的抑制作用,可能是导致盾壳霉田间生防效果不稳定的原因之一。     

小檗公式在小麦条锈菌侵染过程中的表达特征

 小檗是小麦条锈菌的转主寄主,自然条件下在小檗上进行有性生殖不仅是条锈菌毒性变异的重要途径,也为病害的流行提供了初侵染源。目前条锈菌与小麦互作已经有较为细致深入的研究,而条锈菌与小檗分子互作的研究未见报道。NPR1是植物调控防卫反应的一个关键基因,本研究克隆得到小檗NPR1基因(BhNPR1),并对BhNPR1及其下游病程相关基因的表达模式进行了分析。与小麦NPR1基因受条锈菌夏孢子侵染诱导不同,BhNPR1的表达水平在条锈菌担孢子侵染小檗过程中保持稳定。另外,条锈菌侵染小檗过程中NPR1下游的病程相关基因BhPR5和BvPDF1.2a的表达量变化也不明显,而BhPR1和BhPR2则显著上调表达。这些结果表明BhNPR1及多个病程相关基因不参与对条锈菌的防卫反应,这可能是导致小檗先天免疫缺陷而成为多种锈菌共同的转主寄主。     

假禾谷镰孢菌细胞自噬相关基因的鉴定与表达分析

细胞自噬是真核生物中一类包含多种进化保守的Atgs蛋白参与的蛋白质降解途径,该途径也参与多种植物病原真菌的产孢、孢子萌发和致病性过程。本研究利用模式物种已知的Atgs,通过生物信息学分析在假禾谷镰孢菌中鉴定到29个Atgs,分属29种不同蛋白类型。细胞自噬核心调控机制相关蛋白Atg1、Atg6、Atg8和Atg9的氨基酸序列系统进化分析结果显示,Atgs在丝状真菌间非常保守,符合物种进化的特点。通过假禾谷镰孢菌跟亲和与非亲和寄主转录组数据分析发现,与菌丝阶段相比26个Fp Atgs在侵染阶段的表达发生改变,其中Fp Atg1、2、3、4、5、7、8、9、13、22、23、28和Fp Vps34在侵染初期和中后期均诱导表达;Fp Atg6、14、17、20、24、29和Fp Vps15在侵染初期和中后期表达量均降低;Fp Atg10、11除在非亲和互作中后期表达量略有上调,其余阶段均显著下调表达;Fp Atg15、16在亲和互作初期诱导表达,其余阶段均下调表达;Fp Atg26、27在亲和互作初期下调表达,中后期诱导表达,而在非亲和互作初期表达量升高,到中后期下调表达。推测细胞自噬参与调控假禾谷镰孢菌的侵染过程。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组份系统反应调节基因LqRR2的功能研究

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现,不同于其它病原菌造成的杨树溃疡病,该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏,已造成了严重的经济损失,该病原菌的致病分子机制尚不清楚。双组分系统是细菌重要的信号传递通路,在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。开展双组份系统研究将有助于解析欧美杨细菌性溃疡病菌的致病机制。本研究鉴定了欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina双组份孤儿反应调节基因LqRR2,并对其生物学功能进行了研究。通过同源重组获得了LqRR2基因的缺失突变体△LqRR2。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,突变体△LqRR2在半固体培养基上的游动能力显著减弱,对欧美杨‘107杨’枝干的毒性也显著降低。但是,突变体的生长速率、生物膜形成能力以及胞外多糖产量较野生型无显著差别。此外,荧光定量PCR分析结果显示,游动性相关基因flg B、flg C和flg E的表达量在突变体中明显降低。综上所述,双组份调节蛋白编码基因LqRR2是欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina维持病原菌游动性和全毒性所必需的。     

水稻幼穗与Ustilaginoidea virens互作早期的转录组分析

 由子囊菌门真菌稻绿核菌Ustilaginoidea virens引起的稻曲病是世界范围内水稻生产上的重要病害之一。但是,对水稻抗稻曲病的抗性机制仍不清楚。为初步探明水稻与稻曲病菌之间互作早期的分子调控机制,本研究采用比较转录组测序技术对稻曲病菌接种抗病品种‘IR28’和感病品种‘两优培九’(LYP9)6 h的测序数据进行了分析,试图初步阐明水稻抗病分子机制。分析发现,在抗病和感病品种中均差异表达基因有1 005个共表达,在这些基因中,抗病品种中表达上调基因(697个)多于感病品种中表达上调的基因(626个),下调的基因(308个)少于感病品种中下调表达的基因(379个);随后通过GO富集和KEGG代谢途径分析,发现苯丙烷类代谢途径和双萜植保素合成途径相关的基因、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、糖基水解酶和过氧化物酶等基因在抗病品种中被显著诱导上调表达,而在感病品种中基因表达低于抗病品种或下调表达,推测这些基因很可能在水稻与稻曲病菌识别早期发挥重要的抗病作用。该研究结果可为水稻抗稻曲病基因克隆及抗稻曲病分子育种提供理论基础。