多重聚合酶链反应-毛细管电泳-激光诱导荧光法检测三种食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌大肠杆菌O157:H7的uidA基因、沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因的多重聚合酶链反应（PCR）产物的毛细管电泳快速检测方法。根据这3种致病菌的特异性基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增反应体系,采用7.0 g/L 甲基纤维素为筛分介质,毛细管电泳-激光诱导荧光检测法同时检测了3种常见致病菌的PCR扩增产物。在优化的多重PCR反应和毛细管筛分电泳条件下,该方法可以同时检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7基因的多重PCR扩增产物,22 min内即可完成3种常见致病菌的毛细管电泳检测。迁移时间的相对标准偏差为1.47%~2.07%。与凝胶电泳法比较,该法简便快速,灵敏度高,可用于多种致病菌脱氧核糖核酸的检测,为食品安全提供了一种可靠的快速检测方法。     

多响应曲面优化-毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌: 沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbO157基因、志贺菌的ipaH基因及副溶血性弧菌Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因的多重PCR产物-毛细管电泳快速检测方法. 根据沙门菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺菌及副溶血性弧菌的特异性基因保守序列设计出多重PCR引物, 优化PCR 扩增反应体系. 采用多响应曲面法优化毛细管电泳的分离条件, 以含有DNA荧光染料SYBR Green Ⅰ的1.0％甲基纤维素为筛分介质, 通过毛细管电泳-激光诱导荧光同时检测4种常见致病菌的PCR 扩增产物. 在优化的多重PCR反应体系和毛细管筛分电泳条件下, 此方法可以同时检测出沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbO157基因、志贺菌的ipaH基因及副溶血性弧菌Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因的多重PCR扩增产物, 25 min内即可完成检测. 迁移时间的日内相对标准偏差为0.92%~1.58%. 通过多响应曲面的优化, 有效改善了毛细管电泳对DNA分子的分离能力.     

转基因玉米的多重PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光检测方法研究

采用三重PCR反应, 同时扩增CaMV 35S启动子、 hsp70 intron1和CryIA(b)基因之间序列以及Invertase基因, 扩增产物用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光检测, 从而建立了多重PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测转基因玉米的新方法. 对影响多重PCR扩增和毛细管电泳的因素进行了优化. 在优化的条件下, 本方法可以同时检测转基因玉米样品中3种外源基因. 经序列测试证实, 三重PCR 扩增产物的序列与原基因完全一致, 表明扩增结果可靠. 该方法能检出0.05% MON810转基因玉米成分, 远低于欧盟对转基因食品规定标识的质量分数阈值(1％). 该方法对玉米及其制品的检测结果与实时荧光PCR方法的检测结果一致, 与传统的琼脂糖凝胶电泳法相比, 具有特异性高\, 快速及灵敏等优点, 适用于玉米中转基因成分以及转基因玉米MON810品系的快速筛选、 鉴定和检测, 能满足我国实施转基因食品标签法规的要求.     

毛细管电泳-激光诱导荧光法检测HSP70-2基因多态性研究

建立了HSP70-2基因多态性的毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测方法。采用试剂盒法提取人血清标本中全基因组DNA作为模板,选择特异引物进行PCR扩增反应,产物用Pst I限制性内切酶酶切;酶切产物用高灵敏度的SYBR Gold荧光染料标记后,用毛细管电泳-激光诱导荧光法检测。在优化的毛细管电泳-激光诱导荧光条件下,酶切产物在25 min内即可完成检测。GeneRular 100bp DNA ladder在同一天内连续测定6次,迁移时间和峰面积的RSD分别为1.8%~2.9%和2.8%~7.9%;连续6日测定迁移时间与峰面积的RSD分别为2.1%~4.3%和3.5%~9.3%。本研究共检测200份样品,其中G/G分型3份,A/G分型25份,A/A分型172份,检测结果与凝胶电泳结果一致。CE-LIF检测方法具有电泳时间短、试样消耗少、绿色环保等优点,能用于HSP70-2基因多态性的检测。     

毛细管电泳-激光诱导荧光鞘流检测系统优化研究及在基因分析中的应用

对自组装的毛细管电泳 激光诱导荧光鞘流检测装置进行了系统的优化。探讨了鞘流速度、激光功率和检测的位置对检测信号的影响以及鞘流速度与峰面积和理论塔板数的关系。在优化的条件下 ,对荧光素检测的线性范围为 1× 1 0 - 8～1× 1 0 - 1 0 mol L;检出限为 7.5×1 0 - 1 1 mol L(S N =3 )。使用聚N ,N 二甲基丙烯酰胺 (PDMA)为双功能非胶筛分介质 ,将毛细管电泳 激光诱导荧光鞘流检测系统成功地用于DNA片段及基因PCR扩增产物分离检测。     

基于毛细管电泳的环介导恒温扩增技术检测方法研究

以大肠杆菌(E.coli)为对象,采用环介导恒温扩增技术(LAMP)对其扩增,在实验室自制的毛细管电泳-诱导荧光平台上建立了LAMP产物的检测新方法。引物F3,B3,FIP,BIP扩增的E.coli LAMP产物大小为240 bp。优化的毛细管电泳条件为:毛细管有效长度/总长度(10 cm/15 cm),筛分介质溶液为0.5%羟乙基纤维素(1 300 K),电场强度(100 V/cm),进样条件(100 V/cm,1.0 s)。毛细管电泳时,DNA长度在100~500 bp范围内与其迁移时间呈线性关系,相关系数为0.996。在相同毛细管电泳条件下对E.coli LAMP产物进行分析,并利用这种线性关系在电泳图中对E.coli LAMP产物与假阳性产物做区分,结果表明,毛细管电泳技术不仅可在15 min内实现LAMP产物及附加产物的快速检测,而且可快速区分LAMP阳性及假阳性实验产物。采用建立的毛细管电泳快速检测LAMP产物的方法,对AB0174 E.coli基因实施了LAMP,结果表明该方法适合DNA LAMP产物的快速检测。     

食品中沙门菌和单增李斯特菌的多重PCR-芯片电泳快速检测

建立了食品中沙门菌和单增李斯特菌的多重PCR-芯片电泳快速检测方法。根据沙门菌和单增李斯特菌的特征基因合成2对特异性引物,优化聚合酶链反应(PCR)体系,采用芯片毛细管电泳快速检测食品中上述2种致病菌的多重PCR扩增产物。在优化的实验条件下,6 min内即可完成沙门菌和单增李斯特菌的同时检测;迁移时间的日内精密度为0.20%～1.7%,日间精密度3.7%～4.5%。     

毛细管电泳-激光诱导荧光检测分枝杆菌脱氧核糖核酸限制性内切酶谱

建立了毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测（CE-LIFD）分析分枝杆菌脱氧核糖核酸（DNA）限制性内切酶谱的新方法。用聚合酶链反应(PCR)扩增分枝杆菌hsp65基因的长度为439 bp的片段,该扩增片段经限制性内切酶BstEⅡ和 HaeⅢ酶切后,分别用CE-LIFD装置和常规琼脂糖电泳（AGE）对比检测酶切片段。对PCR扩增片段的酶切样品的预处理和CE条件进行了优化,获得了8种分枝杆菌DNA的限制性内切酶谱图。 DNA片段相对迁移时间的相对标准偏差（RSD）≤3.6%。结果表明,CE的分离效能明显高于AGE,是研究DNA限制性内切酶谱的更有效的检测手段。     

微流控芯片-激光诱导荧光快速检测4种食源性致病菌

建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法。根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的rfbO157基因和志贺菌的ipaH基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重PCR扩增,采用微流控芯片-激光诱导荧光检测食品中4种常见致病菌的多重PCR扩增产物。优化了多重PCR扩增和微流控芯片电泳分离的实验条件。当芯片电泳的筛分介质HPMC-50浓度为2.2%、溴乙锭(EB)含量为3.75μmol/L、电场强度为120 V/cm时,pUC Mix DNAMarker-8和待测致病菌的多重PCR扩增产物可以实现基线分离,600 s内即可完成上述4种致病菌的同时检测,迁移时间的日内相对标准偏差为0.74%~2.09%。本方法能够检出1×102cfu/mL的副溶血弧菌、沙门菌、大肠杆菌O157:H7和志贺菌。方法特异性高,所设计的引物在10种非目的菌株体系中均未见扩增的片段。将本法应用于食品中上述致病菌的测定,获得了满意的结果,为常见食源性致病菌的快速检测提供了一种新的可靠分析手段,对保障食品安全具有重要的现实意义。     

高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测生物活性肽的研究

使用毛细管电泳 -激光诱导荧光 -增强型电荷耦合器件(CE -LIF -ICCD)系统 ,用异硫氰酸荧光素(FITC)柱前衍生了亮脑啡肽、甲硫脑啡肽、血管紧张肽、P物质4种生物活性肽 ,优化了实验条件 ,在8min内 ,对它们进行了快速分离检测 ,血管紧张肽的质量检出限达到2.8×10-18 mol。     

增强型电荷耦合器件用于毛细管电泳激光诱导荧光的检测

增强型电荷耦合器件用于毛细管电泳激光诱导荧光的检测马明生，吴晓军，刘国诠（中国科学院化学研究所，北京，１０００８０）关键词增强型电荷耦合器件，激光诱导荧光，毛细管电泳，异硫氰酸荧光黄近年来，毛细管电泳技术在生化分离、分析中得到广泛的应用。目前，毛细管...     

用于毛细管电泳或微芯片电泳的半导体激光诱导荧光检测方法

激光诱导荧光是毛细管电泳和微芯片电泳重要的检测方法。半导体激光器（或称激光二极管）以其价格低、体积小,寿命长、稳定可靠的优势,在激光诱导荧光分析方面,得到了人们的广泛重视。特别是在分析仪器小型化的时代,会带来巨大的影响：本文就其与毛细管电泳和微芯片电泳联用的检测装置、检测方法,荧光试剂,分析应用和发展趋势作了综述。     

毛细管电泳激光诱导荧光检测信号的小波滤噪

采用小波滤噪方法对毛细管电泳激光诱导荧光检测信号进行了处理，研究了小波变换中小波基的选择及噪声阈值的选择对滤噪的影响。结果表明，采用DB4小波基能有效消除毛细管电泳激光诱导荧光检测信号中存在的噪声，使信噪比得到较大改善。     

激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件

寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤.本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF),通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察,研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素,并对其进行优化.结果表明,随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同,其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外,初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同.因此, 在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化.本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为:初始模板的量为105个分子,DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,退火温度70 ℃,18个循环.本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子,降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据.     

毛细管电泳-激光诱导荧光检测肌腱和肌腱细胞中的羟脯氨酸

建立毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)分析羟脯氨酸的方法。肌腱和肌腱细胞中的胶原蛋白碱水解生成氨基酸,经异硫氰酸荧光素(FITC)衍生,采用LIF-CE分离测定胶原蛋白特异性氨基酸-羟脯氨酸。羟脯氨酸在0.5μg/L~8×103μg/L浓度范围内线性关系良好;检出限为0.5μg/L。相对迁移率和相对峰高的相对标准偏差(RSD)分别为5.0%和6.1%。测定了60份肌腱和9份细胞样品,加标回收率为95%~110%。将所建立的毛细管电泳方法与高效液相色谱法(HPLC)进行比较,两者测定结果相对误差为-1.9%~2.0%。本法仅需一次荧光标记,操作简单、快速灵敏,12min内完成一个分析周期,适于测定肌腱和细胞样品。     

用毛细管电泳-激光诱导荧光-增强型电荷耦合检测器测定痕量氨基酸

本文对用毛细管电泳－激光诱导荧光－增强型电荷耦合检测器测定氨基酸衍生物进行了研究。考察了荧光黄异疏氰酸酯衍生氨基酸的各种条件。在优化条件下，10－8～10－6mol／L浓度范围内精氨酸与其衍生物的荧光强度呈良好的线性关系，最小可衍生化的精氨酸浓度为5×10－10mol／L。     

毛细管电泳—激光诱导荧光法分离检测DNA片段与基因扩增产物

以羟丙甲基纤维素和非交联聚丙烯酰胺溶液为筛分介质，将毛细管电泳－激光诱导荧光法用于ＤＮＡ片段及基因扩增产物的分离检测。探讨了非胶筛分介质中高分子化合物的浓度、电解质的浓度、内插试剂用量等对ＤＮＡ片段分析检测的影响；考察了ＤＮＡ片段迁移时间和峰面积的重现性及ＤＮＡ片段定量检测的关系，建立了一种快速、灵敏的ＤＮＡ片段及基因扩增物分离检测方法。     

毛细管电泳免疫化学发光检测鼠血管平滑肌细胞中zmol骨形成蛋白-2

近年来,结合毛细管电泳的免疫分析研究在不断加强.特别是毛细管电泳免疫激光诱导荧光(CEIA-LIF)检测由于具有较高的灵敏度而十分引人注目.常文保等用CEIA-LIF检测雌三醇,检出限为31.6ng/L,可用于血清和尿样分析.Kennedy等用芯片CEIA-LIF检测了鼠胰腺细胞中的胰岛素,     

毛细管电泳技术在氨基酸分析中的研究进展

对毛细管电泳技术在氨基酸分析中的研究进展进行了综述,分析了直接法和衍生法对氨基酸进行分析的优缺点,详细叙述了毛细管电泳中的紫外、激光诱导荧光、电化学及质谱等检测方法在氨基酸分析中的应用,并重点总结了毛细管电泳在手性氨基酸分离中的应用.     

激光技术在聚合酶链式反应微流控芯片中的应用

评述了激光技术在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)微流控芯片领域中的应用进展,包括激光技术在PCR微流控芯片微加工、微流体物理参数测量、温度循环控制以及芯片上在线产物检测(包括荧光实时定量/终点和毛细管电泳检测)中的应用。最后,展望了激光技术在未来基于PCR的微全分析系统(micro-total analysis system,μTAS)中的新应用。