稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8的特性分析

 有性生殖在真菌的生活史和进化过程中具有重要作用,而交配型基因是控制有性生殖的关键因子。前期研究发现稻曲病菌(Villosiclava virens)MAT1-2型菌株中包含MAT1-2-1和MAT1-2-8两个交配型基因,但是它们如何调控稻曲病菌有性生殖依然不清楚。本文研究了它们在不同侵染和生长发育时期的表达模式和编码的蛋白结构特性。研究表明MAT1-2-1在侵染不同阶段一直下调表达;而MAT1-2-8在侵染早期(5 dpi)上调表达,在侵染后期下调表达。与营养菌丝阶段比较,MAT1-2-1和MAT1-2-8在有性发育过程菌核形成、菌核萌发、子座原基形成和子座成熟4个阶段的表达量都是下降的,在菌核形成阶段表达量最低。生物信息学分析显示MAT1-2-1和MAT1-2-8具有磷酸化位点,为非分泌蛋白,无明显的跨膜结构域。蛋白同源比对分析表明MAT1-2-1与香柱菌(Epichloë typhina)的MAT1-2-1同源性最高,而MAT1-2-8与绿僵菌(Metarhizium)的MBR_08192蛋白同源性最高。进一步研究发现MAT1-2-1和MAT1-2-8能够互作,并分别主要定位在细胞核和细胞基质中。通过质谱技术鉴定到MAT1-2-1的一些候选互作蛋白,如假定Ran交换因子Prp20/Pim1(KDB12229.1)、假定rRNA处理蛋白Ebp2(KDB12923.1)及组蛋白H1(KDB12711.1)等。因此,以上结果为研究稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8调控有性生殖的生物学功能奠定了基础。     

球孢白僵菌有性世代培养及子代毒力稳定性鉴定

在利用球孢白僵菌Beauveria bassiana有性态改良球孢白僵菌菌株的研究中,菌株的选择非常重要,其中利用交配型基因选择菌株是必要手段。而且虫生真菌的有性态能够使菌株间产生基因交流,促进其进化的过程。为更好地研究球孢白僵菌的遗传规律,以获得避免菌种衰退的方法,本研究建立了分别以柞蚕蛹为活体寄主和糙米培养基为基质的2种人工培养有性世代繁殖体系。结果表明,交配型为MAT1-1-1型和MAT1-2-1型混合型菌株BbDPSD5,经过自交在2种基质上均能够产生有性态。而具有2种单一交配型的菌株BbOFDH1-5和BbDPSD2进行配伍试验,BbOFDH1-5×BbDPSD2、BbOFDH1-5×BbDPSD5和BbDPSD2×BbDPSD5在2种基质上均没有有性态产生。对获得的有性态子囊孢子经无性繁殖产生的菌株进行r DNA-ITS片段以及交配型基因检测,并对测序结果进行比对分析。结果显示,扩增得到的r DNA-ITS序列和MAT1-2-1交配型基因与亲本序列同源性为100%,而没有检测到MAT1-1-1型。2种培养方式获得的结果完全一致。对有性态子代子囊孢子产生的株系进行毒力测试结果表明,所有子代菌株与原始菌株BbDPSD5的毒力差异不显著,子代交配型基因虽然缺失了MAT1-1-1,但是毒力没有衰退,未出现菌种退化现象。     

稻曲病菌有性生殖中光诱导基因的转录组分析

 稻曲病菌(Villosiclava virens)能够以菌核的形式安全越冬并在来年萌发产生子囊孢子,成为稻曲病菌的重要初侵染源;而菌核产生子实体的过程需要光的诱导。为了探索光诱导的分子机制,本文对不同光照处理条件下稻曲病菌菌核萌发过程的转录组学进行了比较分析。结果发现,与黑暗条件下菌核的萌发相比,光照处理后542个基因显著差异表达,其中上调359个,下调183个。GO富集分析发现,DEGs显著富集于糖基水解酶活性、细胞壁生物合成、氧化还原酶活性等。KEGG分析发现,DEGs显著富集于脂质代谢、氨基酸代谢、次生代谢产物合成等代谢通路。DEGs中子实体独有基因组氨酸激酶为光感受器,其响应光信号引起下游基因的表达,同时,与有性生殖过程相关的水通道蛋白和甲基转移酶蛋白编码基因表达活跃,共同调控了菌核萌发产生子实体过程。     

禾谷镰孢菌γ-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

 根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084(PH-1)的γ-微管蛋白基因核苷酸序列设计5对引物,采用PCR方法从禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)的敏感菌株、室内诱导及田间多菌灵抗药性菌株中分段扩增测序,获得了γ-微管蛋白基因全序列。该基因全长1 868bp,含有5个内元,编码一含493aa的多肽;与PH 1的γ-微管蛋白基因核苷酸序列同源性99%,存在10个差异核苷酸,与所编码的氨基酸序列同源性100%;与其它7种真菌的γ-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为31%~72%。中国的2个敏感菌株和4个抗药菌株的γ-微管蛋白基因序列完全相同,认为多菌灵抗药性与该微管蛋白变异无关。     

小麦白粉病菌有性生殖与自然群体交配型检测

 本研究根据MAT1-1-1(GenBank登录号HQ171902)和MAT1-2-1(GenBank登录号HQ171899)的部分基因序列设计和筛选其特异性引物,使用PCR方法对2012年度采自四川、陕西、云南、贵州、河南、安徽、江苏、河北、山东和甘肃10个省30个采集地点共516个小麦白粉病菌菌株的交配型基因进行检测。结果显示30个采集地点两种交配型基因都能检测到,其中28个采集地的两种交配型菌株比例(MAT1-1-1 :MAT1-2-1)符合1:1。选择具不同交配型基因的小麦白粉病菌株配对接种,16个随机杂交组合都能产生闭囊壳。对获得的闭囊壳进行子囊孢子释放,均可获得子囊孢子。该研究结果为深入研究有性生殖对小麦白粉病菌株毒性多样性的作用奠定了基础。     

稻曲病菌bZIP转录因子UvbZIP12的功能研究

 稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)侵染水稻穗部引起的真菌病害,严重影响稻米的产量和品质。bZIP转录因子参与多种植物病原菌的生长发育和致病过程。稻曲病菌中有28个bZIP转录因子,但其具体功能尚未被研究。本研究对bZIP转录因子UvbZIP12在稻曲病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析。稻曲病菌接种水稻后,UvbZIP12基因表达量逐渐升高,在接种后3 d和5 d时具有最高表达量。对UvbZIP12基因的敲除转化子分析发现,敲除转化子ΔUvbZIP12在PSA、PDA、YTD培养基上生长速率显著加快,菌丝干重显著增加;产孢量减少;对NaCl和sorbitol的耐受性增强,对SDS、CR、CFW和H₂O₂的耐受性减弱;对水稻的致病力无明显变化。结果表明,稻曲病菌UvbZIP12参与调控生长发育和对非生物胁迫的耐受性,但不参与致病。     

玉米大斑病菌两性交配型菌株的出现频率及其育性分析

玉米大斑病菌属于异宗配合真菌,在自然界中存在A、a交配型菌株和Aa两性交配型菌株,为明确两性菌株的出现频率及其对有性生殖的影响,采用有性态诱导和交配型PCR鉴定的方法,对2011—2014年采集的野生菌株及室内诱导产生的有性杂交后代F1、F2代进行交配型组成鉴定,通过检测两性菌株子囊壳和子囊孢子的发育情况明确其有性生殖能力,结合RT-PCR技术对有性生殖过程中MAT1和MAT2基因的表达情况进行分析。结果表明,野生菌株和有性杂交后代中均存在两性交配型菌株,且出现频率相当,介于2.09%和6.25%之间;Aa两性菌株的育性与杂交时对应菌株的交配型组成相关,两性菌株与A交配型菌株或a交配型菌株杂交均可育,能产生成熟的子囊壳和子囊孢子,但其自交时败育,只产生子囊壳,不产生子囊孢子。两性菌株Aa自交和两性菌株Aa与A交配型或与a交配型菌株杂交时,Aa菌株中MAT1和MAT2基因表达量无明显差异,推测MAT基因在有性生殖产生子囊壳的过程中发挥了重要作用。     

水稻幼穗与Ustilaginoidea virens互作早期的转录组分析

 由子囊菌门真菌稻绿核菌Ustilaginoidea virens引起的稻曲病是世界范围内水稻生产上的重要病害之一。但是,对水稻抗稻曲病的抗性机制仍不清楚。为初步探明水稻与稻曲病菌之间互作早期的分子调控机制,本研究采用比较转录组测序技术对稻曲病菌接种抗病品种‘IR28’和感病品种‘两优培九’(LYP9)6 h的测序数据进行了分析,试图初步阐明水稻抗病分子机制。分析发现,在抗病和感病品种中均差异表达基因有1 005个共表达,在这些基因中,抗病品种中表达上调基因(697个)多于感病品种中表达上调的基因(626个),下调的基因(308个)少于感病品种中下调表达的基因(379个);随后通过GO富集和KEGG代谢途径分析,发现苯丙烷类代谢途径和双萜植保素合成途径相关的基因、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、糖基水解酶和过氧化物酶等基因在抗病品种中被显著诱导上调表达,而在感病品种中基因表达低于抗病品种或下调表达,推测这些基因很可能在水稻与稻曲病菌识别早期发挥重要的抗病作用。该研究结果可为水稻抗稻曲病基因克隆及抗稻曲病分子育种提供理论基础。     

禾谷镰刀菌蛋白激酶FgSid1的功能研究

 实验室前期已经对禾谷镰刀菌中116个蛋白激酶进行了鉴定,发现FgSID1基因(FGSG_07344)敲除突变体在有性生殖过程中存在严重缺陷,但其在禾谷镰刀菌中的具体功能却未被详细报道。本研究通过表型分析和亚细胞定位等实验明确了FgSid1在营养生长、有性发育和致病性等方面的功能。本研究发现FgSID1基因敲除突变体菌落生长速度显著变慢,分生孢子隔膜数量减少且产孢量下降;在有性生殖阶段,FgSID1基因敲除突变体的子囊壳形态和大小均正常,但子囊畸形且子囊孢子形成有缺陷;此外,FgSID1基因敲除突变体只能侵染接种小花,而无法扩展到穗轴及临近的小穗,且接种点的小麦籽粒DON毒素含量显著下降;研究还发现FgSID1基因敲除突变体的分生孢子、营养菌丝和子囊孢子的分隔中均含有多个细胞核;本研究又通过亚细胞定位实验发现FgSid1定位于微管组织中心。因此,蛋白激酶FgSid1可能通过参与禾谷镰刀菌无性和有性阶段的细胞分裂影响禾谷镰刀菌的营养生长、分生孢子和子囊孢子的发育以及侵染能力。     

Mating type gene MAT1-2-1 is common among Japanese isolates of Verticillium dahliae

Mating type genes of Verticillium dahliae, a wilt pathogen affecting many plant species, were identified to examine sexual recombination between Japanese pathotypes. We amplified a DNA sequence encoding high mobility group (HMG) box from V. dahliae using PCR. A cloned genomic DNA fragment included a sequence homologous to MAT1-2-1 gene. Despite that sequence's presence in all V. dahliae isolates we used, MAT1-1-1 (an opposite mating type gene) was never amplified. We concluded that V. dahliae is potentially heterothallic. Furthermore, sexual bias practically obviates sexual recombination between Japanese pathotypes. This report describes, for the first time, a mating type gene of phytopathogenic Verticillium.     

Phylogenetic,genetic, and phenotypic diversity of Pseudomonas syringae pv. syringae strains isolated from citrus blast and black pit in Tunisia

Citrus blast and black pit caused by Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) is the only bacterial disease reported in Tunisian Citrus orchards. The phylogenetic relationship between Pss strains was studied based on multilocus sequence analysis (MLSA), using partial sequences of housekeeping genes rpoD, rpoB, gyrB, cts, and pfk for 14 representative Pss Citrus strains, including the reference strain LMG5496. The MLSA revealed that the studied Tunisian Citrus strains are closely related to LMG5496 and cluster in phylogroup 02. Based on the cts gene, the majority of Citrus strains clustered in clades “a” and “b”. However, five strains were placed in a newly defined clade “g”. We describe the presence of six different type III secreted effectors (T3SEs). These were found with frequencies of 100% for the effector hopAN1 and the helper hrpK1, 65% for hopT1-2, and 14% for hopN1, hopR1, and hopQ1-2. Investigation of copper resistance showed that 67% of our Pss Citrus strains from Tunisia are resistant to copper sulphate in vitro, and the copper resistance genes copABCDR were detected in 23% of the strains. Our results present new data concerning the genetic diversity and phylogeny, presence of T3SEs, and copper resistance within the Pss populations that affect Citrus in Tunisia.     

蝉棒束孢交配型基因的分析和检测

蝉棒束孢Isaria cicadae为药用真菌蝉花的无性型,在防治同翅目害虫上具有重要作用。在自然状态下蝉棒束孢多以孢梗束状态存在,其子实体阶段极为少见。交配系统是真菌有性生殖过程中的决定因素,因此可从交配型的角度探究蝉棒束孢有性子实体稀少的原因。本研究运用RACE技术首次从蝉棒束孢中克隆出MAT1-1-1与MAT1-2-1全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。根据cDNA序列设计并优化得到蝉棒束孢交配型鉴定引物,并对采集自安徽地区40株蝉棒束孢交配型进行鉴定,结果表明交配型MAT1-1菌株14株、MAT1-2菌株26株,并没有检测到同时含有两种交配型或两种交配型全部缺失的现象,因此蝉棒束孢有性型子实体几无发生的现象并不完全归因于交配型因素。     

Mating type gene MAT1-2-1 is common among Japanese isolates of Verticillium dahliae

Mating type genes of Verticillium dahliae, a wilt pathogen affecting many plant species, were identified to examine sexual recombination between Japanese pathotypes. We amplified a DNA sequence encoding high mobility group (HMG) box from V. dahliae using PCR. A cloned genomic DNA fragment included a sequence homologous to MAT1-2-1 gene. Despite that sequence's presence in all V. dahliae isolates we used, MAT1-1-1 (an opposite mating type gene) was never amplified. We concluded that V. dahliae is potentially heterothallic. Furthermore, sexual bias practically obviates sexual recombination between Japanese pathotypes. This report describes, for the first time, a mating type gene of phytopathogenic Verticillium.     

河南省小麦全蚀病菌的分离及变种类型鉴定

 从河南省10个地市采集的小麦病根样品中分离得到82株病原分离株, 通过形态特征观察、回接致病性测定、以及分子生物学的方法对所分离菌株进行鉴定。其中47个菌株菌丝分支处都形成典型的“∧”状;子囊壳埋生或半埋生, 子囊棍棒状, 子囊孢子线形, 稍弯曲, 无色, 具有5~10个分隔, 大小为68~94 μm×2~4 μm;对82个分离株rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定, BLAST序列比对结果表明, 47株菌株与小麦全蚀病菌的ITS序列同源性达97%～99%, 据此确定47株菌株为小麦全蚀病菌。应用小麦全蚀病菌4个变种的特异性引物进行PCR扩增都得到禾顶囊壳小麦变种(870 bp)的特异性片段, 鉴定47株菌株均为禾顶囊壳小麦变种 (Gaeumannomyces graminis var.tritici)。     

Identification mating-type locus structure and distribution of <Emphasis Type="Italic">Cochliobolus lunatus</Emphasis> in China

Cochliobolus lunatus (teleomorph: Curvularia lunata) is an important plant pathogenic fungus that causes the maize foliar spot, resulting in serious yield losses. In ascomycetes, a single mating-type (MAT) locus with two idiomorphs controls sexual development. The structure and arrangement of the MAT genes were examined to understand the MAT locus of C. lunatus. MAT loci were MAT1–1-1 or MAT1–2-1, flanked upstream and downstream by regions encoding GTPase activating protein, pyridoxamine phosphate oxidase domain, and β-glucosidase. A MAT1–1 or MAT1–2 idiomorph was identified in single isolate, and sexual reproduction in vitro indicated that the species was heterothallic. In vitro crossing between isolates with opposite MATs produced perithecia, asci, and ascospores. A multiplex MAT-specific PCR method was developed and used to test mating-type genes in 177 C.lunatus isolates collected from China. The ratio of isolates of each mating-type in China was consistent with a 1:1 ratio.