微粒子化学发光免疫测定促甲状腺素敏感性方法的建立与应用

目的 :建立一种低成本、高敏感性检测血清促甲状腺激素(TSH)的微粒子化学发光免疫分析 (CLEIA)方法。方法 :采用碱性磷酸酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体 (mAb) ,与FITC偶联的抗TSHα亚单位的另一mAb配对 ,构成双抗体夹心免疫结合 ,用抗FITC多抗免疫磁珠做固相分离载体 ,用金刚烷胺CSPD为发光底物的非均相免疫分析法。结果 :方法灵敏度 4 μIU/L ,批内变异系数 (CV)平均为7.4 5 % ,批间CV平均为 10 .4 5 % ,回收率为 91.4 %～ 10 2 .4 %。将实际样品测定与ACS 180  系统检测的结果相比较有较好的相关性。结论 :微粒子化学发光定量测定TSH的成本低、灵敏度及特异性高和稳定性好 ,具有广阔的应用前景     

磁分离酶联免疫荧光法(MEIF)检测人血清中胰岛素

目的:采用磁微粒分离酶联免疫荧光(MEIF)分析技术建立一种简便、高敏感性、定量检测人血清胰岛素(insulin)的新方法.方法:选用2株识别人胰岛素不同表位的单克隆抗体(mAb).一株mAb用异硫氰酸荧光素(FITC)标记, 另一株用碱性磷酸酶(AP)标记;偶联羊抗FITC抗体的磁珠用作固相分离载体, 4-甲基磷酸伞型酮用作荧光底物.结果:成功建立了定量检测人血清胰岛素的MEIF, 灵敏度2.0 μIu/mL, 线形范围0～188.52 μIu/mL, 批内变异系数(CV)为4.3%～5.2%, 批间CV为2.6%～9.5%, 稀释回收率为93%～117%, 加标回收率为94%～113%.实际样品的测定结果与倍爱康公司商品化人insulin磁分离发光系统检测试剂盒的检测结果比较, 具有良好的相关性.结论:MEIF定量测定人insulin方法成本低、灵敏度高、稳定性好, 在临床免疫检测领域具有广阔的应用前景.     

氯霉素磁分离酶联免疫(MEIA)检测方法的建立

目的:采用磁分离酶联免疫分析法(MEIA)建立定量检测氯霉素(CAP)的一种高灵敏度方法.方法:采用免疫竞争法,用异硫氰酸荧光素(FITC )标记抗CAP抗体,碱性磷酸酶(AP)标记CAP,以羊抗FITC抗体包被的免疫磁珠作为固相分离载体,单磷酸酚酞做显色底物,建立检测CAP的MEIA法.结果:成功建立了检测CAP的MEIA法,检测时间为40 min,检测灵敏度为0.03μg/L,线性范围为0.1～8.1μg/L,批内变异系数(CV) 3.9%-5.3%,批间CV 4.8%-8.1%,回收率为97%～101.5%,与国标方法液相色谱一串联质谱法的检测结果对比,相关系数r=0.9817.结论:检测CAP的MEIA法的灵敏度及准确率高、检测时间短,为食品中氯霉素残留的监测提供了一种新的免疫分析方法.     

磁性分离酶免疫法在唐氏综合征产前筛查中的应用

目的 :探讨磁性分离酶免疫分析技术 (magnetic -separatedenzymeimmunoassay ,MEIA)在唐氏综合征产前筛查中的实用性。方法 :对MEIA方法测定孕中期母血清甲胎蛋白 (AFP)和游离 β -绒毛促性腺激素 (β -HCG)含量进行方法学检测 ,同时与酶联免疫吸附法 (ELISA)和放射免疫法 (RIA)相比较。并通过检测及随访 1745例孕产妇建立了青岛地区孕中期母血清各孕周AFP、β-HGC中位数值。结果 :MEIA -AFP方法的灵敏度 <0 .2 1IU/ml,批内平均变异系数 (CV)为 4.7% ,批间平均CV为 6 .8% ,平均回收率为 97.4% ,与ELISA、IRMA法高度相关 (r=0 .90 0和 0 .986 )。MEIA - β -HCG方法的灵敏度为 1mIU/ml,批内平均CV为 2 .4% ,批间平均CV为 2 .4% ,平均回收率为 99.6 % ,与ELISA、IRMA法高度相关 (r=0 .942和 0 .976 )。建立了青岛地区孕中期产前筛查各孕周中位数值 ,其随孕周变化趋势与文献报道一致。筛查中暂未发现漏检病例。结论 :MEIA方法适用于测定孕中期母血清AFP和 β -HCG含量 ,进行唐氏综合征和开放性神经管畸形的产前筛查。     

促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制

目的:研制人血清中促甲状腺素(TSH)的化学发光免疫检测试剂盒.方法:采用辣根过氧化物酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体(mAb),与固相包被的抗TSHα亚单位的另一mAb配对,以鲁米诺作为底物,采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法.结果:该方法灵敏度为0.0788 mIU/L,批内CV平均为4.7%,批间CV平均为8.4%,平均回收率为93.05%.该检测与LH、FSH和HCG无交叉反应.部分实验样品的测试结果显示该试剂与国外同类试剂(雅培architect i2000)的测定结果明显相关(r＝0.984).结论:该方法具有较高的灵敏度、重复性和准确度,与其他同类产品相比简便、快捷、成本低,适于临床检测和科研应用.     

磁分离酶联免疫法检测IL-4方法的建立

建立磁分离酶联免疫法定量检测人白细胞介素4(IL-4)的方法.用异硫氰酸荧光素(FITC)和碱性磷酸酶(AP)分别标记识别不同表位的两种抗IL-4单克隆抗体(mAb), 用抗FITC多抗或mAb包被免疫磁珠.结果显示: 检测标准品浓度在0-3ng/mL范围内线性关系良好, 敏感性达10pg/mL, 平均回收率为101.7%,批内批间CV均为3.6%,与ELISA比较相关系数为0.9124.此法所需样本量少, 方法稳定, 敏感性高和特异性强, 又无放射性污染, 在临床检验和基础研究中有较大应用价值.     

抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)的单克隆抗体(mAb).方法:利用从人工流产刮宫物中提取的HCG免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞同NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合, 采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞株, 并对mAb的亚型、亲和力及特异性进行鉴定.结果:共获得26株能稳定分泌抗HCG特异性mAb的杂交瘤细胞株.mAb的亚类均为IgG1, 亲和力介于1.14×108～2.0×108 mol/L之间, 其中4株mAb与HCG的β亚基有较强的反应, 而与黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)均无交叉反应.结论:成功获得4株鼠抗人HCG mAb的杂交瘤细胞株, 其分泌的mAb能特异识别人HCG的β亚基, 可用于早孕、肿瘤等诊断的进一步研究.     

癌胚抗原的时间分辨免疫荧光分析及其诊断试剂的研制

目的利用时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)技术,建立一种人血清癌胚抗原(CEA)的快速全自动检测方法并研制其诊断试剂。方法采用双抗体夹心法(用1株抗CEA的mAb M86160M用于包被微孔板,另1株抗CEA的mAbM86110M用于标记铕)建立CEA-TRFIA,增强液采用β-二酮体为主的发光增强系统。结果CEA-TRFIA的线性测量范围为(1~560)μg/L,分析的灵敏度为0.28μg/L,批内和批间的变异系数(CV)分别为7.2%~8.6%和8.9%~13.2%。与AFP、CA12-5、CA19-9和白蛋白均无交叉反应,与CA15-3的交叉反应值为1.62μg/L。将1000份血清标本用本法与国外罗氏化学发光试剂盒同时检测,其相关系数(r)为0.946。结论CEA-TRFIA的各项指标均达到临床检测的要求,可替代国外同类检测试剂盒,用于临床血清CEA水平的测定。     

人促黄体生成素吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立及评价

目的建立基于磁微粒-吖啶酯化学发光系统的人促黄体生成素(LH)全自动定量测定方法。方法根据双抗体夹心法原理,选择一株抗-LH单克隆抗体偶联磁微粒,吖啶酯标记另一株抗-LH单克隆抗体,建立LH化学发光免疫分析方法,并优化了反应体系、反应时间等影响因素,使整个系统达到最佳检测性能。结果本检测方法线性范围为0.25~250IU/L,空白检测限0.01IU/L,不同浓度样本的分析内精密度1.1%~4.4%、分析间精密性1.5%~4.2%,与hCG、FSH、TSH均无明显交叉反应,与贝克曼Access全自动化学发光免疫测定系统回归方程为Y=0.989X+0.214,相关系数r=0.988。结论成功建立了人促黄体生成素的吖啶酯全自动化学发光免疫分析方法,各项指标均满足临床检测的要求,具有一定的临床应用价值。     

小鼠抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆抗体的制备及应用

目的制备并纯化具有高特异性的抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆抗体(mAb),并进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记,鉴定标记的mAb与肿瘤细胞的结合能力。方法小鼠腹水诱生法制备并纯化抗AEG-1 mAb,Western blot法和免疫组织化学染色检测mAb的纯度及免疫活性。流式细胞术检测FITC标记mAb的标记效率,流式细胞术及免疫细胞化学染色检测FITC标记mAb与肿瘤细胞的结合能力。结果纯化得到了具有较高纯度的抗AEG-1 mAb,免疫活性良好;流式细胞术检测结果显示,FITC标记的mAb标记的肿瘤细胞表面荧光强度明显增加,标记率可达到90%以上;FITC标记的mAb可特异性识别并结合AEG-1阳性表达的肿瘤细胞,还能与小鼠体内注射的肿瘤细胞结合,在BALB/c小鼠血液中可检测出荧光染色阳性的肿瘤细胞。结论成功制备出小鼠抗AEG-1 mAb并进行了FITC标记,标记的mAb在体内外均可与肿瘤细胞特异性结合。     

化学发光免疫分析法检测黄体生成素和癌胚抗原的性能评价

目的评价化学发光免疫分析法检测黄体生成素和癌胚抗原.方法通过对不同浓度样品黄体生成素(LH)、癌胚抗原(CEA)含量的测定,进行精密度、灵敏度、干扰、回收试验.结果批内CV均小于5%,批间CV均小于6.5%;LH、CEA回收率分别为97.9%～102.2%、98.9%～102.4%,灵敏度分别达到2.4IU/L、2.6ng/ml;无吸样间的交叉污染.结论该方法各项指标结果准确,精密度好、灵敏度高、干扰小,具有广泛的应用前景.     

神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析法的建立

研制检测人血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)的光激化学发光免疫分析(AlphaLISA)快速检测试剂盒。采用受体微球用一株NSE单克隆抗体包被,用生物素标记一株单克隆抗体,与链霉亲和素的供体微球共同组成检测试剂盒,优化反应体系并对试剂盒的各项性能指标进行评价。结果显示:自制NSE试剂盒灵敏度为0.149 ng/ml,线性范围为0.149~600ng/ml,分析内、分析间的精密度分别为3.7%~4.3%、3.9%~5.2%,与细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、非神经元性烯醇化酶(NNE)均无交叉反应,154份临床血清样本用本试剂盒与罗氏化学发光试剂盒检测,其相关系数为0.979。发现自制NSE-AlphaLISA试剂盒的各项性能指标均能达到临床检测要求,可用于临床血清样本NSE浓度的测定。     

6-酮-前列腺素F_(1α)酶免疫分析

本文报告了6-酮-前列腺素(PG)F_(1α)的酶免疫分析法。用混合酸酐法交联β-半乳糖苷酶和6-酮-PG-F_(1α)。通过双抗体沉淀法分离免疫复合物和游离6-酮-PGF_(1α)。以4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷作底物测定酶促反应产物的荧光强度。该方法6-酮-PGF_(1α)最低检出值0.054 pmol(20pg),批内变异系数(CV)平均3.84％,批间CV平均6.72％,回收率平均105.2％。分别用酶免疫分析和放射免疫分析法测定同一家兔主动脉样品6-酮-PGF_(1α)含量,相关系数r=0.9474。用消炎痛和咪唑作为工具药验证了该方法在药理研究中应用的可行性。     

前列腺特异抗原化学发光免疫分析方法的建立及初步应用

建立的前列腺特异抗原(PSA)化学发光免疫分析(CLIA)使用2株抗PSAMcAb,一株McAb包被微孔板,另一株McAb与HRP连接。底物是鲁米诺/H2O2/对碘苯酚系统的双抗体夹心一步法,测定范围0.5～64ng/mL,最低检出值为0.13ng/mL,平均回收率为100.6%,批内和批间CV分别小于8.3%和11.5%,正常参考值小于3.5ng/mL。1000份血清临床考核,与参比试剂盒临床符合率一致,具有同等的临床诊断价值。     

C-肽双标记液相IRMA方法的实验研究

本文探讨应用两株高特异性配对C-P McAb分别标记125I和异硫氰酸荧光素(FITC),采用抗FITC磁性微粒子固相抗体作为分离剂,建立血清C-P IRMA检测法。结果表明,本法标准曲线范围为0.125~4.0pmol/mL,灵敏度为0.06 pmol/mL,批内批间CV分别为5.6%和8.7%,回收率为92.1%~96.0%,和胰岛素交叉反应为零。各项技术参数表明本法操作简便快速,为今后开发肽类的IRMA检测提供了特异性更高的手段。     

甲状腺过氧化物酶抗体TRFIA技术的建立及临床应用

目的:建立甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)竞争检测法。方法:用TPO抗原包板,用Eu3+标记羊抗鼠IgG做标记物,TRFIA检测人血清中的TPOAb。结果:TPOAb-TRFIA的灵敏度为1.0IU/ml;批内CV为3.2%～5.3%,批间CV为3.6%～5.6%;平均回收率为97.95%;热稳定性好;与电化学发光分析技术(ECLIA)比对,相关系数达0.9861;女性TPOAb测定值显著高于男性(P<0.01),且人群中TPOAb的阳性率女性也显著高于男性;TPOAb的正常值范围为≤32.6IU/ml。结论:本法建立的TPOAb-TRFIA是一个高灵敏和可靠的检测,有助于甲状腺疾病的临床诊断。     

β2-MG时间分辨荧光免疫试剂盒的研制及质量考核

为建立灵敏度好、特异性高的TRFIA检测β2-MG,以羊抗鼠IgG固相抗体,Eu3 标记的β2-MG与标本β2-MG共同竞争限量的抗β2-MG鼠单克隆抗体(mAb),以Log-Logit制作标准曲线.本法检测灵敏度为0.01 mg/L,检测范围为0.1～8.0 mg/L;试剂及包被板在37℃放置7天后,监测标准曲线的ED20、ED50、ED80未见明显偏移;批内CV,批间CV分别为4.1%和7.8%,与美国PE试剂盒所测结果的相关系数为0.9364,说明两者具有良好的相关性.本法检测β2-MG灵敏度高,特异性好,试剂盒存放时间长且无放射性污染,是一种有应用前景的检测方法.     

链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用

目的：建立链霉亲和素-生物素双抗体夹心一步法测量人胰岛素化学发光免疫分析方法,并进行临床应用检测。方法：以链霉亲和素包被微孔板,生物素化一株单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记另一株单克隆抗体。校准品与胰岛素国家标准品进行溯源,建立免疫分析方法,进行性能参数测试。收集40例正常人、12例1型、29例2型糖尿病人血清,统计整理参考值,并与国外同类试剂盒进行对比。结果：该方法回收率94.13%,线性范围（2～200）μIU/ml,灵敏度0.05μIU/ml,批内、批间变异系数（CV）分别为2.87%～7.06%和3.24%～9.14%,与牛胰岛素、猪胰岛素、人前胰岛素原、胰岛素样生长因子Ⅰ交叉反应率分别为27.2%、19.7%、0.16%、0.07%,与C肽、胰高血糖素、生长抑素无交叉反应。本法与国外同类试剂盒同时检测40份正常人葡萄糖耐量试验血清,r为0.9869,本法37℃7d热稳定性良好,建立一组正常人葡萄糖耐量参考值。结论：本法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类产品水平,反应快速,操作简单,便于临床检验应用。     

促甲状腺激素生物素-亲和素酶促化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种低成本、高灵敏度的检测血清促甲状腺激素(TSH)的生物素-亲和素酶促化学发光免疫分析方法。方法引入生物素-亲和素放大系统,一株抗TSH的单克隆抗体包被微孔板,另一株标记生物素,辣根过氧化物酶标记链亲和素,鲁米诺作为发光底物,采用夹心法,建立TSH酶促化学发光免疫分析方法。结果方法分析灵敏度为0.01mIU/L,批内变异系数为2.01%～5.40%,批间变异系数为2.96%～17.9%,回收率为90.6%～114.4%,高值促甲状腺激素血清样品经系列倍比稀释后,测定值与稀释度呈线性关系,相关系数大于0.99,与原子高科TSH免疫放射分析方法和罗氏电化学发光分析法的测定值具有良好的相关性。结论生物素-亲和素TSH酶促化学发光免疫分析方法具有成本低、灵敏度高、特异性高和稳定性好的特点,具有广阔的应用前景。     

电化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附法测HBsAb效果评价

用电化学发光免疫分析法(ECLIA)和ELISA分别测定不同浓度乙肝表面抗体(HBsAb),并对结果进行分析比较.结果表明: ECLIA法测HBsAb的批内CV: 高值为0.95%, 中值为1.13%, 低值为2.63%, 批间CV: 高值为4.03%, 中值为4.93%, 低值为7.34%, 灵敏度为4IU/L; ELISA法测HBsAb的批内CV: 高值为5.76%, 中值为12.8%,低值为15.9%,批间CV: 高值为10.1%, 中值为19.6%, 低值为25.2%, 灵敏度为19IU/L.5种用ELISA法筛选的165例标本, 除3例ECLIA法HBsAb阳性, ELISA法HBsAb阴性, 不符合外, 其他162例两种方法结果一致.总之,用ECLIA测定HBsAb的各技术参数优于ELISA法.