贝伐单抗对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖及纤维化的影响

目的：观察贝伐单抗对体外培养的人视网膜色素上皮细胞ARPE－19增殖及钙黏连蛋白（ E－cadherin ）和纤维连接蛋白（ fibronectin ）表达变化的作用,探讨贝伐单抗对ARPE－19增殖及纤维化的影响。方法：用不同浓度（0、0．625、1．25、2．5、5．0mg／mL）的贝伐单抗干预体外培养人视网膜色素上皮细胞ARPE－19,采用CCK－8法分别于24、48、72 h检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;应用免疫蛋白印迹法（ Western blotting）及逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测ARPE－19中E－cadherin和fibronectin的蛋白及mRNA的表达变化。结果：浓度为2．5、5．0 mg／mL贝伐单抗能有效抑制ARPE－19细胞的增殖及细胞周期,差异有统计学意义（ P＜0.05）。2．5、5．0 mg／mL贝伐单抗能抑制E－cadherin 基因,促进fibronectin基因的转录及表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论：高浓度的贝伐单抗能够抑制ARPE－19细胞的增殖,下调纤维化相关因子E－cadherin ,同时上调fibronectin的表达,提示高浓度的贝伐单抗可以引起ARPE－19细胞纤维化。     

缓激肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化的影响

目的　制作增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）细胞模型,研究缓激肽（bradykinin,BK）对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞发生EMT的影响,并探讨BK对PVR的影响机制。方法　体外培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,采用不同浓度转化生长因子-β1（transforming growth factor- β1,TGF- β1）分别作用于ARPE-19细胞24 h、48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8检测细胞增殖情况,确定TGF-β1浓度及作用时间;利用Western blot和细胞免疫荧光检测EMT标志蛋白E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和波形蛋白（Viminten）表达情况;细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移能力。同时采用Western blot检测TGF/Smad通路下游pSmad3和Smad7的表达。结果　TGF- β1刺激ARPE-19细胞后可以成功诱导EMT体外细胞模型。当TGF-β1浓度为10 μg·L^-1、作用时间为48 h时,细胞增殖最明显。BK在TGF- β1诱导的EMT中可以降低α-SMA、Viminten的表达,升高E-钙黏素的表达并且降低细胞迁移能力。这些影响能被BK-2受体拮抗剂HOE-140逆转。TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT时,pSmad3表达量升高;TGF-β1刺激前给予BK刺激,pSmad3表达量减少;加入BK前预敷HOE-140,然后给予TGF-β1刺激,BK作用减弱,pSmad3表达量升高。Smad7表达趋势与pSmad3表达趋势相反。结论　10 μg·L^-1 TGF-β1可导致ARPE-19细胞发生EMT。BK通过TGF-/Smad信号通路上调Smad 7的表达、下调pSmad 3的表达,从而逆转TGF-β1诱导的EMT。提示BK可能是一种新的、有效的治疗PVR的方法。     

Src-家族酪氨酸激酶特异性抑制剂对H2O2介导的晶状体上皮细胞Ca2＋内流的影响

目的观察Src-家族酪氨酸激酶（SFK）抑制剂PP1对H2O2诱导的晶状体上皮细胞（LECs）内游离钙离子（Ca2＋）浓度变化的影响。方法用Ca2＋荧光探针Fluo-3/AM负载人晶状体HLE-B3,用激光共焦显微镜观察在不同浓度H2O2刺激后细胞内Ca2＋的荧光强度变化;进一步用0.1nmol/LPP1、0.3μmol/（L·min）过氧化氢酶和DMSO分别预处理细胞,观察在常规Ca2＋、低Ca2＋和高Ca2＋培养基条件下H2O2刺激后细胞内Ca2＋荧光强度的变化,评价PP1对H2O2诱导的LECs内Ca2＋的作用。结果不同浓度H2O2刺激后细胞内游离Ca2＋浓度升高,呈剂量依赖效应。用0.1mmol/LH2O2刺激细胞,在常规Ca2＋培养基中,PP1组和过氧化氢酶组细胞内Ca2＋荧光强度增长幅度与DMSO组比较分别降低（28.5±4.2）%、（33.8±3.7）%,差异均有统计学意义（q=3.73,P〈0.05;q=4.21,P〈0.05）。在低Ca2＋培养基中,3个组细胞内Ca2＋荧光强度增强均不明显;在高Ca2＋培养基中,PP1组、过氧化氢酶组的荧光强度增加幅度较DMSO组分别降低（13.5±1.8）%和（21.3±2.4）%（q=5.58,P〈0.01;q=7.11P〈0.01）。常规Ca2＋和高Ca2＋培养基中,PP1组和过氧化氢酶组细胞内Ca2＋荧光强度增长幅度的差异均无统计学意义（q=3.04,P〉0.05;q=2.76,P〉0.05）。结论 SFK特异性抑制剂PP1能有效抑制H2O2诱导的LECs的Ca2＋内流,从而阻断依赖Ca2＋激活的信号转导途径,阻止皮质性白内障的发生。     

Bax、Bcl2在丙烯醛诱导的ARPE19细胞凋亡中的作用

目的观察Bax、Bcl2蛋白在丙烯醛诱导的体外培养ARPE19细胞凋亡中的作用。方法 将培养的ARPE19细胞置于含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基中,于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育;用不同浓度(50μmolL-1、100μmolL-1)丙烯醛处理对数期培养的ARPE19细胞24h,设不加药的空白对照组,用流式细胞仪检测丙烯醛诱导ARPE19细胞的凋亡情况,Westernblot检测ARPE19细胞中Bax、Bcl2蛋白的表达情况。结果 流式细胞仪显示,早期在空白对照组中细胞凋亡率为2.97%,50μmolL-1丙烯醛处理组中为4.67%,100μmolL-1丙烯醛处理组中为50.07%;晚期凋亡细胞在空白对照组中细胞凋亡率为1.66%,50μmolL-1丙烯醛处理组中为2424%,100μmolL-1丙烯醛处理组中为6.77%。Westernblot显示空白对照组的Bax/Bcl2蛋白表达的比值为02939,50μmolL-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl2蛋白表达的比值为1.3892,100μmolL-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl2蛋白表达的比值为1.4961。结论 丙烯醛可以通过激活凋亡蛋白Bax及抑制抗凋亡蛋白Bcl2的表达来导致ARPE19细胞凋亡。     

缓激肽对体外培养兔角膜内皮细胞增殖状况及对闭锁小带蛋白-1与相关性核酸结合蛋白表达的影响

目的　观察缓激肽（bradykinin，BK）对体外培养家兔角膜内皮细胞增殖及对紧密连接相关蛋白闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、闭锁小带蛋白-1相关性核酸结合蛋白（zonula occludens-1-associated nucleic-acid-binding protein，ZONAB）表达的影响，初步探讨BK促进角膜内皮细胞增殖的作用机制。方法　选择对数生长期的兔角膜内皮细胞，向培养基中分别加入0.01、0.10、1.00、10.00 μmol·L^-1 BK(BK组)，对照组不做加药处理，倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化和增殖状况，MTT法检测各组细胞在24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度(A)值，Western blot检测72 h各组细胞中紧密连接处ZO-1与核内ZONAB蛋白的表达。结果　加药 72 h，各组细胞融合成片并紧密连成单层，加药96 h后各组细胞生长受限，细胞间隙变大，脱落细胞增多。与对照组相比，除0.01 μmol·L^-1 BK组24 h外，其余浓度BK处理后A值升高、增殖活力增强，差异均有统计学意义 （均为P<0.001），并呈现出一定的浓度依赖性，其中1 μmol·L^-1 BK作用最强 （P<0.001）。Western blot结果显示BK可促进紧密连接处ZO-1与核内ZONAB蛋白的表达，且呈一定的浓度依赖性。结论　BK体外刺激可促进兔角膜内皮细胞的增殖，具有浓度和时间的依赖性，其作用机制可能与ZO-1与ZONAB介导的信号通路有关。     

氯离子通道阻滞剂对人RPE细胞增生抑制作用的实验研究

目的探讨氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3苯丙氨基）苯甲酸（NPPB）在人视网膜色素上皮（RPE）细胞增生中的作用。方法培养人RPE细胞株，ARPE-19细胞；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度的NPPB对ARPE-19细胞增生的影响；利用血清饥饿法对ARPE-19细胞进行细胞周期同步化，并通过流式细胞仪加以确定；进行核仁染色，观察NPPB对ARPE-19细胞周期进行中核仁变化的影响。结果NPPB浓度依赖性地抑制了ARPE—19细胞的增生；核仁染色显示了ARPE-19细胞核仁数量和形态随着细胞周期进行而发生变化，NPPB使ARPE-19细胞核仁萎缩，抑制核仁形成，使细胞处于静息状态。结论氯离子通道阻滞剂NPPB能够抑制静止期的ARPE—19细胞进入细胞周期。从而抑制ARPE—19细胞的增生。     

褪黑素对高糖刺激人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的研究褪黑素对高糖刺激体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）细胞诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达的影响。方法培养人RPE细胞,分为对照组、甘露醇组、高糖组和高糖＋褪黑素组,作用48h后,光镜观察细胞形态;MTT法检测细胞活性;免疫荧光染色法和Western blot检测RPE细胞中iNOS的蛋白表达。结果MTT检测结果表明高糖可以抑制RPE细胞增生,加入褪黑素后,抑制作用减弱;免疫荧光染色法和Western blot检测结果表明,与对照组相比,高糖组iNOS蛋白表达明显增高,加入褪黑素后,iNOS表达被显著抑制。结论高糖可以抑制RPE细胞增生,诱导RPE细胞iNOS的表达上调,而褪黑素可减轻细胞损伤。     

氧化锌抑制紫外线B诱导的人晶状体上皮细胞Ca2+-ATP酶1表达

目的 研究纳米材料氧化锌在有/无紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射下对人晶状体上皮细胞系B-3(human lens epithelial cell B-3,HLEB-3)细胞质膜Ca2+-ATP酶1(plasma membrane calcium ATPase1,PMCA1)表达的影响.方法 HLEB-3细胞进行培养和传代,在有/无UVB照射情况下,加入不同浓度的氧化锌,利用DAPI染色细胞核;Annexin V/PI染色检测细胞凋亡;Fluo-3/AM染色检测细胞内Ca2浓度的变化;实时荧光定量PCR检测PMCA1 mRNA表达水平;Western blot方法检测PMCA1蛋白表达水平.结果 DAPI细胞核染色结果显示,氧化锌以浓度依赖方式使HLEB-3细胞产生典型的细胞凋亡反应;UVB照射可增加氧化锌对HLEB-3细胞的毒性效应;在UVB照射下,经氧化锌(2.5 μg· mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg· mL-1)处理的HLEB-3细胞凋亡及细胞内Ca2浓度增加(均为P＜0.05),细胞内Ca2水平分别从(156.34±4.59) nmol·L-增加到(173.88±7.17)nmol· L-1、(289.02±9.09)nmol·L-1、(488.36±48.16) nmol·L-,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);在无UVB照射下,2.5 μg· mL-1、5.0 μg· mL-1、10.0μg·mL-1氧化锌组细胞PMCA1 mRNA表达分别是0μg·mL-1氧化锌组的0.75倍、0.57倍和0.41倍,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05);而在有UVB照射下,各浓度氧化锌组细胞PMCA1 mRNA表达分别是0μg·mL-1氧化锌组的0.64倍、0.24倍和0.09倍,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 氧化锌和UVB照射通过Ca2信号转导通路对HLEB-3细胞有协同抑制作用,提示氧化锌在有UVB照射的情况下对后发性白内障的治疗有巨大潜在作用.     

曲安奈德对培养的人视网膜色素上皮细胞的毒性作用

目的探讨曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对视网膜色素上皮细胞可能潜在的毒性作用。方法质量浓度0mg·L-1、10mg·L-1、30mg·L-1、300mg·L-1TA分别作用ARPE19细胞24h和72h后通过TUNEL和电镜观察2种方法从形态和功能方面观察TA对ARPE19细胞生长的影响。结果(1)TUNEL法:质量浓度10mg·L-1TA不影响ARPE19细胞的生长,但是随着质量浓度增大,细胞凋亡程度逐渐增强(t=2.921,P<0.01),随着时间延长,ARPE19细胞的凋亡指数逐渐增大(t=2.306,P<0.01);(2)电镜:质量浓度10mg·L-1TA作用后ARPE19细胞状态良好,但是随着质量浓度增加,细胞走向凋亡的形态越明显,微绒毛消失,核染色质边集,凋亡小体形成。结论一定浓度的TA能够诱导视网膜色素上皮细胞的凋亡,而且这种凋亡效应呈浓度和时间依赖关系。因此,TA对视网膜色素上皮细胞可能有潜在毒性。     

视网膜动脉平滑肌细胞中大电导钙离子激活钾通道电流和钙离子浓度变化对糖尿病视网膜动脉收缩的影响

背景 糖尿病视网膜病变(DR)是常见的视网膜微血管并发症,视网膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道(BK)是调节血管舒缩和血液动力的主要因素.目前关于视网膜动脉平滑肌细胞(RASMCs)上BK通道的功能变化在DR形成中的作用鲜有研究报道. 目的 研究正常及糖尿病模型大鼠RASMCs中BK通道电流、钙离子浓度及不同钙离子浓度下BK通道开放概率(NP0)的变化,探讨DR早期的血管损伤机制. 方法 采用随机数字表法将50只SPF级8～12周龄SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病模型组,糖尿病模型组40只大鼠腹腔内注射60 mg/kg链脲佐菌素(STZ)法制作1型糖尿病模型,正常对照组大鼠10只同法注射枸橼酸钠溶液.采用酶消化法分离大鼠RASMCs,应用全细胞膜片钳技术记录大鼠RASMCs中BK通道电流;采用荧光探针法测定大鼠RASMCs内钙离子浓度;采用膜内向膜外型单通道膜片钳技术记录不同钙离子浓度条件下RASMCs中BK单通道NP0的变化.结果 36只大鼠糖尿病造模成功,造模成功率为90％.刺激电压大于60 mV时,糖尿病模型组大鼠RASMCs中BK通道电流密度明显下降,刺激电压为100 mV时,正常对照组和糖尿病模型组大鼠RASMCs BK通道电流分别为(100±23) PA/PF和(50±7) PA/PF,差异有统计学意义(t=19.80,P＜0.05).当加入BK通道特异性阻滞剂非洲蝎毒素100 nmol后,正常对照组的BK通道电流明显减弱,而糖尿病模型组BK通道电流无明显变化;正常对照组和糖尿病模型组大鼠RASMCs内钙离子浓度分别为(123±11)nmol/L和(255士10)nmol/L,差异有统计学意义(t=32.50,P＜0.05).在刺激电位为60 mV条件下,随着钙离子浓度增加,BK通道NP0增加,差异有统计学意义(F=15.28,P＜0.05).结论 糖尿病模型大鼠RASMCs中BK通道电流下降,细胞内钙离子浓度升高,BK单通道NP0下降.BK通道功能改变可能是导致糖尿病时视网膜动脉异常收缩的主要原因之一.     

紫杉醇对视网膜色素上皮细胞功能的破坏及其潜在机制

目的:探究抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡、周期、形态和视网膜外屏障的潜在毒性作用。方法:体外培养ARPE-19细胞,将细胞分为对照组(正常培养基培养)、加药物组(PTX)。不同浓度PTX(0.005、0.05、0.5、5mg/L)处理ARPE-19细胞12、24、36、48、72h,CCK8法检测不同浓度PTX不同时间点对ARPE-19细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同浓度PTX不同时间点对ARPE-19细胞凋亡的影响及周期阻滞作用;免疫荧光观察细胞形态变化;Western blot检测凋亡相关蛋白表达及屏障功能相关蛋白表达;通过测量细胞跨上皮电阻检测药物对细胞屏障的影响。结果:PTX使ARPE-19细胞的增殖能力降低,0.005mg/L PTX处理36h,细胞增殖开始受影响;同时,PTX加速细胞凋亡且与时间、药物浓度呈依赖性,流式检测细胞周期可明显得出细胞被阻滞于G2-M期。0.05mg/L PTX处理24h后,细胞形态发生明显改变,正常细胞呈梭形或不规则形,加药物组中,细胞数相对减少且形态趋于圆形;0.05mg/L PTX破坏视网膜屏障功能,药物处理后细胞跨上皮电阻显著降低且紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达较对照组显著降低(P<0.05)。Cleaved-caspase-3、Bax的表达量较对照组显著增加,Bcl-2的表达量较对照显著降低(P<0.05)。结论:PTX对ARPE-19细胞的增殖、凋亡,且依赖与时间及浓度;此外,PTX对ARPE-19细胞周期及形态均产生影响。同时PTX可破坏视网膜的屏障功能,提示抗肿瘤药物存在对视网膜潜在的毒性作用。     

蓝光诱导视网膜色素上皮细胞铁死亡的机制研究

目的:探讨蓝光诱导人视网膜色素上皮(ARPE)细胞铁死亡的发生及可能机制。方法:体外培养的ARPE-19细胞接受405nm蓝光50mW/cm²辐照度照射不同时间,分为对照组、16.3J/cm²组、32.6J/cm²组和65.2J/cm²组;将65.2J/cm²组定为高能量蓝光照射组,进一步分为对照组、高能量蓝光照射组和高能量蓝光照射+铁死亡抑制剂组,CCK-8检测细胞活力,试剂盒检测细胞内谷胱甘肽(GSH)含量、二价铁离子浓度及丙二醛(MDA)含量,Western blot法检测细胞内GPX4和xCT蛋白相对表达量。结果:蓝光照射导致ARPE-19细胞活力下降呈剂量依赖性,高能量蓝光照射导致细胞内GSH含量下降,二价铁离子浓度和MDA含量上升(均P<0.05);加入铁死亡抑制剂可部分恢复蓝光照射组细胞活力和GSH含量,减少MDA含量,降低二价铁离子浓度(均P<0.05);蓝光照射组GPX4和xCT蛋白相对表达量显著下降,加入铁死亡抑制剂后蛋白表达量不同程度恢复(P&...     

CERKL通过激活SIRT1/E2F1轴减轻蓝光导致的人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤

目的：探讨神经酰胺类似蛋白(CERKL)是否通过激活沉默信息调节因子1(SIRT1)/E2F转录因子1(E2F1)轴减轻蓝光导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激损伤。

方法：培养人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞，蓝光照射后观察细胞形态变化，PCR与蛋白免疫印迹法测定细胞CERKL的表达情况； 分别采用siRNA-CERKL与pcDNA3.1-CERKL转染ARPE-19细胞，蓝光暴露处理后，采用MTT法测定细胞活力，TUNEL法检测细胞凋亡情况，分析氧化应激标志物的含量与SIRT1/E2F1轴的表达情况； 随后转染siRNA-SIRT1至ARPE-19细胞，再次测定蓝光照射下细胞氧化应激损伤状况。

结果：蓝光照射后，ARPE-19细胞逐渐收缩成圆球状，且出现空泡； 蓝光照射导致CERKL表达水平升高(P<0.05)，同时观察到细胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，活性氧、丙二醛与8-羟基脱氧鸟苷含量升高(P<0.05)； 沉默CERKL会加剧此现象，而上调CERKL则能缓解此变化(P<0.05)； 上调CERKL同时激活了SIRT1表达，促进了E2F1的脱乙酰化(P<0.05)，而沉默SIRT1能逆转上调CERKL对蓝光导致ARPE-19细胞氧化应激损伤的缓解作用(P<0.05)。

结论：CERKL通过激活SIRT1表达，促进E2F1脱乙酰化，从而减轻蓝光诱发的ARPE-19细胞氧化应激损伤。     

lncRNA KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖诱导的人视网膜上皮细胞增殖与凋亡

目的：观察长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖(HG)诱导的人视网膜上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡与氧化应激情况。

方法：运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测5、15、45、135mmol/L HG刺激的ARPE-19的细胞存活率。将ARPE-19细胞分为NC组、45mmol/L HG组、si-NC+45mmol/L HG组、si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、miR-NC+45mmol/L HG组、miR-19a-3p mimics+45mmol/L HG组、si-con+45mmol/L HG组、si-TSHZ3+45mmol/LHG组、pcDNA+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、pcDNA-TSHZ3+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组。运用CCK-8检测细胞存活率,qRT-PCR检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-19a-3p和TSHZ3 mRNA表达,Western Blot检测TSHZ3、活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)蛋白质的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测氧化应激指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平。双荧光素酶活性检测lncRNA KCNQ1OT1和miR-19a-3p、miR-19a-3p和TSHZ3之间的靶向结合。

结果：15、45、135mmol/L HG抑制ARPE-19细胞的存活率,后续选择细胞存活率约50%的HG浓度45mmol/L。45mmol/L HG提高ARPE-19细胞中lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3 mRNA、TSHZ3蛋白表达水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平,降低miR-19a-3p表达水平、细胞存活率(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3低表达或miR-19a-3p高表达提高HG诱导的ARPE-19细胞的存活率,降低凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1靶向miR-19a-3p,miR-19a-3p靶向TSHZ3,lncRNA KCNQ1OT13通过miR-19a-3p调控TSHZ3的表达。lncRNA KCNQ1OT1低表达对HG诱导的ARPE-19细胞存活率、凋亡以及氧化应激的影响被TSHZ3过表达所逆转。

结论：lncRNA KCNQ1OT13低表达通过miR-19a-3p/TSHZ3,促进HG诱导的ARPE-19,并抑制其凋亡和氧化应激。     

洛美利嗪对膳食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠视网膜神经节细胞凋亡的保护作用

目的：探讨洛美利嗪(LOM)对高脂饮食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的保护作用。

方法：小鼠54只随机分为两组,高脂饲料喂养19wk,其中一组同时每天按80mg/kg给予LOM灌胃。筛选出肥胖组(DIO)和肥胖+洛美利嗪组(DIO+LOM),对照组(CON)小鼠给予基础饲料。至第19wk末,应用透射电镜观察各组小鼠RGCs的超微结构改变,采用TUNEL法检测各组小鼠RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。

结果：透射电镜结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠RGCs体积变小,细胞质分布紊乱,核染色质发生固缩,而DIO+LOM组小鼠RGCs的形态学改变较DIO组明显减轻。TUNEL法检测结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠GCL层可见较多的凋亡细胞,其细胞凋亡率显著升高(P<0.01),DIO+LOM组RGCs的凋亡率与DIO组比较显著降低(P<0.05)。激光共聚焦结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠RGCs内Ca²⁺荧光染色明显增强,其荧光染色强度比值显著升高(P<0.01),而DIO+LOM组RGCs内Ca²⁺荧光染色强度较DIO组有明显下降(P<0.01)。

结论：洛美利嗪对肥胖引起的RGCs的损伤和凋亡具有保护作用,其机制可能与减轻细胞内Ca²⁺超载有关。     

miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的：探讨miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响,并初步研究其分子机制。

方法：选择人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19细胞),将细胞分为7组：空白对照组(不处理)、无义miRNA组(转染mimic NC)、miRNA-147模拟物组(转染miRNA-147 模拟物)、抑制剂阴性对照组(转染shRNA NC)、VEGF抑制剂组(转染VEGF抑制剂)、miRNA-147模拟物+空载病毒载体组(转染miRNA-147模拟物和空载体)和miRNA-147模拟物+VEGF过表达组(转染miRNA-147模拟物和VEGF过表达)。使用RT-qPCR检测各组细胞miRNA-147及VEGF mRNA表达水平; 双荧光素酶实验验证miRNA-147与VEGF靶向关系; Western blot检测VEGF蛋白表达水平; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期的改变; 细胞划痕实验检测细胞迁移。

结果：与空白对照组和无义miRNA组相比,miRNA-147模拟物组miRNA-147表达水平显著升高,VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与抑制剂阴性对照组相比,VEGF抑制剂组VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与miRNA-147模拟物+空载病毒载体组相比,miRNA-147模拟物+VEGF过表达组VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告显示VEGF是miRNA-147的靶基因。转染miRNA-147 模拟物和VEGF抑制剂均可降低ARPE-19细胞增殖和迁移水平,促进细胞凋亡(P<0.05)。转染VEGF过表达可逆转miRNA-147 mimic对ARPE-19细胞增殖、迁移和凋亡的影响(P<0.05)。

结论：miRNA-147可通过靶向VEGF抑制ARPE-19细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。     

自噬激活剂雷帕霉素对 A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的　探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（A2E）诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞自噬调节的影响。方法　取人RPE细胞（ARPE-19细胞系）进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组:使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:使用含20 μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组:使用含100 nmol·L^-1雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组:使用100 nmol·L^-1雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20 μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测各组细胞自噬标志物LC3蛋白的表达。结果　与对照组相比,A2E组细胞生存率显著下降（P<0.001）,而雷帕霉素联合A2E组细胞生存率得到了部分恢复,与A2E组相比差异有统计学意义（P<0.01）。与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中10种细胞因子含量均有所下降（均为P<0.01）。与对照组相比,雷帕霉素组细胞内出现散在自噬囊泡,A2E组细胞内出现较多的自噬囊泡,而雷帕霉素联合A2E组细胞内出现大量聚集的大体积的自噬囊泡。与对照组相比,A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量显著升高（P<0.001）,P62蛋白相对表达量显著降低（P<0.001）;与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量明显升高（P<0.01）,而P62蛋白相对表达量明显降低（P<0.001）。雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞内LC3蛋白的绿色荧光斑点大量聚集,与A2E组相比荧光强度增加,斑点体积更大,数量也更多。结论　雷帕霉素能够进一步激活A2E诱导的ARPE-19细胞自噬活性,一定程度上降低了A2E对RPE细胞造成的损伤,并抑制了ARPE-19细胞中炎症因子和血管生成因子的分泌。