端粒酶核酶hTERT 5''RZ时辰治疗人肝癌裸鼠移植瘤

我们在既往的研究中 ,为探讨肝癌裸鼠移植瘤细胞DNA合成与端粒酶表达的生物节律 ,在时辰同步化裸鼠中构建了肝癌细胞SMMC 772 1裸鼠移植瘤。继续在程控光照条件下饲养 ,于光照后 3,6 ,9,1 2 ,1 5 ,1 8,2 1小时取样 ,用流式细胞仪测定各时期细胞DNA含量 ,细胞周期分布及端粒酶活性水平。结果 ,肝癌裸鼠移植瘤细胞DNA合成随昼夜节律变化 ,且伴随端粒酶活性的同步节律变化 ,均在光照后 2 1小时达高峰 ,光照后 9小时处于低谷 ;节律周期呈余弦分布。表明 ,肝癌裸鼠移植瘤的生长与端粒酶活性表达在静止相达高峰 ,为制定肿瘤时辰化疗方案提…     

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的 体外研究锤头型α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件。同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响。方法 将含α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ)，经体外^32P标记转录后形成产物靶RNA。同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-gⅠ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录，产物(核酶)与各自的^32P-靶RNA按不同的条件混和反应，电泳后放射自显影观察结果。将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内，采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响。结果 两种核酶在37℃、42℃均能有效切割各自的靶RNA，对Mg^2 浓度的要求范围较宽(10～20mmol／L)；反应温度从65℃逐渐降至并维持在37℃的条件下核酶切割活性显提高。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低，胶原蛋白生成降低，胶原生成明显受抑制。结论 针对α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成。     

核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的 探讨靶向低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控.方法 采用脂质体介导的方法,将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2,并予低氧条件诱导.于转染后48 h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平;荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性.结果 Hep3B2细胞低氧诱导后,HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高(1.0±0.02),转染核酶基因400 μmol/L后48 h,Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降,HIF-1转录活性下调(0.12±0.025,P＜0.05).结论 核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α的表达,降低其转录活性.     

MDR1特异性核酶逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的探讨MDR1核酶（N2A＋tRNAi^met-iMDRl-sRz，sRz）在裸鼠体内逆转人肝癌组织多药耐药（MDR）的可行性。方法将原发性MDR人肝癌组织裸鼠原位移植模型第2代随机分为A组（空白对照组：生理盐水40μl＋Lipofect AMINE^TM2000 10μ1）、B组（阴性对照组：N2A＋tRNAi^met 10μg／40μl＋Lipofect AMINE^TM2000 10μl）和C组（核酶组：sRz 10μg／40μl＋LipofectAMINE^TM2000 10μl），均开腹瘤内注射。瘤内注药1周后用表阿霉素15mg／kg腹腔注射，每周1次，连续4周。彩色B超测量肿瘤体积。化疗结束后1周处死裸鼠，RT-PCR、Western blot法检测肿瘤中MDR1 mRNA及其蛋白P-gp的表达。结果C组每次化疗后肿瘤体积均较前缩小（F=659．99，P〈0．05）。除第1次化疗外，其余各次化疗后C组的抑制率均高于A、B组（F=35．36，12．77，97．60，P〈0．05）。化疗结束后，C组与瘤源以及A、B组相比，肿瘤组织中MDR1 mRNA和P-gp的表达明显降低（F=45．36，3590．40，P〈0．05）。结论sRz可有效降低肝癌细胞表达MDR1 mRNA和P-gp，一定程度上逆转MDR，提高E-ADM的化疗效果。单纯E-ADM化疗可使肝癌组织MDR1 mRNA和P-gp表达升高，诱导MDR的产生。     

抗端粒酶核酶抑制肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的研究

设计针对端粒酶RNA组分的特异性核酶，研究该核酶对肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。构建含针对端粒酶RNA组分锤头状核酶基因的重组真核表达质粒pBBS212-RZ，以及建立人肝癌细胞株HepG2裸鼠移植瘤模型。将不同剂量的pBBS212-RZ用脂质体包裹后进行瘤体内多点注射，对照组注射生理盐水或空质粒载体pBBS212。连续注射2l天后，测量移植瘤体积和重量，检测瘤组织端粒酶活性。抗端粒酶特异性核酶使瘤组织端粒酶活性下降(抑制率为72％)，明显地抑制了肝癌细胞裸鼠移植瘤生长(抑制率为68％)，且存在剂量依赖性。抗端粒酶特异性核酶作为一种有效的端粒酶抑制剂，可抑制肝癌细胞的生长，有望在肝癌基因治疗中发挥作用。     

冠脉旁路术中转染抗NF-κB核酶基因防治犬移植静脉桥再狭窄的研究

大隐静脉是冠脉旁路手术中重要的移植血管桥，然而其远期通畅率却较动脉桥低，10年通畅率仅有60％左右，其中又有50％的患者伴有不同程度的移植血管再狭窄，因此限制了其应用。而动脉桥来源有限且取材不便，也影响了冠脉搭桥手术的发展。我们以pUC-SRα为载体，阳离子脂质体介导的针对NF-kB mRNA的核酶R65转染冠脉旁路术模型犬静脉移植血管，观察其抑制内膜形成及中膜平滑肌增生的作用。     

一种基于可设计核酶的非天然氨基酸的tRNA氨基酰化系统

识别 t RNA身份的能力对基因编码系统的功能是必需的。翻译时氨酰 t RNA合成酶 (ARSs)识别 t RNA的身份并装配上与它们关联的氨基酸。文中证明一种体外进化的核酶也能区分专一的 t RNA,并能将氨基酸转移到关联 t RNA3’端。该核酶能与 CCA-3’末端和 t RNAf Met的反密码子环相互作用 ,且它的 t RNA专一性受这些相互作用控制。利用这一特性能设计核酶对专一 t RNA的选择性 ,从而定制有效的氨酰基转移催化剂。该法可用来产生非天然氨基酸装配的氨酰 t RNA,且它们能通过无细胞翻译系统合成蛋白质一种基于可设计核酶的非天然氨基…     

核酶在病毒性感染基因治疗中的应用

核酶与底物ＲＮＡ结合后行使其切割功能，可用于降特定的ｍＲＮＡ，控制多种病毒感染以及用于癌症的治疗。ＲＮＡ在病毒和其他疾病中具有重要的作用，针对ＨＩＶ基因组的基本结构，利用核酶特异性降解靶ＲＮＡ的特性，人们成功地设计对针对ＨＩＶ－１不同结构ＲＮＡ的核酶并成功地介导了核酶基因转入ＣＤ４＾＋细胞或细胞株的基因治疗。除ＡＩＤＳ外，核酶还成功地用于抗ＨＢＶ，ＨＰＶ等病毒性感染的研究中。     

核酶研究的进展

核酶作为一种特异性抑制转录后基因表达的遗传操作工具 ,已在基因治疗和后基因组研究领域显示出其巨大的应用价值。目前 ,人们正致力于提高核酶在体内的活性 ,以及寻找新的更有价值的核酶结构。本文就在核酶的设计 目标剪切位点的选择 促进核酶剪切活性的额外因子 用体外筛选方法获得新型核酶、在哺乳动物模型中的应用等方面的进展以及核酶研究中应注意的问题作一介绍