土壤环境基因组技术及其在新药发现中的应用

土壤是微生物最重要的生境，土壤微生物具有极大的多样性。然而传统培养技术只能得到约1％的微生物纯培养，其余都是未被纯培养微生物。利用土壤环境基因组技术，可以把未被纯培养微生物的基因克隆到载体中并在宿主中进行表达，获得比已培养微生物丰富的代谢产物多样性，这为我们发现新颖结构先导化合物以及新药开辟了新的道路。本文介绍应用环境基因组技术构建土壤DNA文库的思路和方法。     

指数富集的配基系统进化技术及其在血管研究中的应用

指数富集的配基系统进化技术是一种生物文库技术,它利用人工合成的、容量约为1014~1015的随机寡核苷酸文库与靶物质结合,经过多轮筛选获得靶物质的DNA或RNA适配子,具有实用范围广、筛选过程简便、适配子有高特异性和高亲和性等特点。在血管研究方面主要是针对血管内膜增生和新生血管形成开展的,在该领域发展潜力巨大。     

大鼠脊髓损伤修复差异表达cDNA文库的构建

目的　 运用改良消减杂交技术构建大鼠脊髓损伤修复过程中出现的差异表达基因文库 ,为寻找在脊髓损伤后的修复过程中起关键作用的分子提供帮助。方法　在经典消减杂交的基础上引进SMART反转录、长距离PCR、磁性分离系统、离心柱色谱等方法建立改良消减杂交技术 ,通过两轮消减杂交构建差异表达基因的cDNA消减文库 ,并对文库中的差异基因进行批量克隆与生物信息学分析。结果　 将两轮消减杂交后的差异表达基因转化大肠杆菌JM10 9以建立差异表达基因文库 ,库容量大小为 2× 10 3。从文库中随机挑取 90个克隆进行酶切鉴定与测序分析 ,得到 4 0个差异基因序列 ,其中 32个已知序列 ,8个新序列。 结论　 通过改良消减杂交成功建立了脊髓损伤修复过程中出现的差异表达基因文库 ,为筛选在大鼠脊髓损伤修复过程中起关键作用的基因 ,进一步探讨脊髓损伤修复的分子机制奠定了基础     

一种鉴别免疫筛选噬菌体克隆真、假阳性的方法

目的探讨及早鉴别用免疫学方法筛选cDNA文库得到的阳性克隆是否真实可靠的方法.方法将阳性噬菌体克隆与宿主菌按一定的比例诱导培养后,取沉淀做SDS-PAGE后行W estern b lot;同时取出一个阳性克隆进行亚克隆,直至3次亚克隆均为全部阳性.结果3次亚克隆均为全部阳性的噬菌体克隆,在W estern b lot鉴定中也呈阳性反应.结论可用W estern b lot方法来鉴别用免疫学方法筛选cDNA文库得到的阳性克隆是否真实可靠.     

人脑胶质瘤cDNA文库的构建

作者用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取人脑胶质瘤总ＲＮＡ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离ｐｏｌｙ（Ａ￣＋）ＲＮＡ为模板，合成的ｃＤＮＡ长度为０．２～５ｋｂ。胶质瘤ｃＤＮＡ插入片段克隆到λｇｔ１１载体，所获得的重组子在体外进行包装。该ｃＤＮＡ文库滴度为１．１２×１０￣５，克隆效率为４．８×１０￣３／ｎｇｃＤＮＡ。本文库为研究人脑胶质瘤的基因结构与功能提供了重要基础。     

利用环境基因组学开发新抗生素

中国科学院微生物研究所的朱宝利研究员介绍了环境基因组学和新抗生素的开发之间的关系。他指出，环境基因组学研究主要采取两种策略：一是从微生物混合群体细胞中提取总DNA并建立其基因组文库，如Fosmid和BAC文库等，然后，对文库进行某一特定基因的功能性筛选。     

吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库的构建

目的:构建吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库.方法:建立大鼠吗啡躯体依赖模型后,取鼠脑进行总RNA的抽提、mRNA的纯化,以mRNA为模板合成第一链cDNA后用LD-PCR方法合成双链cDNA,用限制性内切酶SfiⅠA、B分别双酶切双链cDNA与pTRG载体,连接后的cDNA文库转化XL1-Blue MRF′ Kan 超级感受态并收菌,完成cDNA文库构建.结果与结论:PCR结果显示,cDNA片段连接效率＞90%,cDNA插入片段在1 kb左右.吗啡依赖大鼠脑cDNA文库总容量为3.05×106,满足下一步细菌双杂交文库筛选要求.     

全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略

基因全长cDNA克隆是研究基因功能的前提之一。新基因全长cDNA克隆的方法很多，目前比较可行且应用较多的主要是cDNA库筛选。本主要介绍了近年来比较常用的全长cDNA库的构建及全长cDNA的克隆(包括“电子”基因克隆)的策略和方法及其进展。     

胃癌组织中DNA依赖性蛋白激酶KIP2表达及意义

DNA依赖性蛋白激酶(DNA—dependent protein kinase catalytic subunit，DNA—PKcs)是唯一由DNA末端激活的真核细胞激酶，它在双链DNA损伤修复中起重要作用，生化分析指出DNA—PKcs激酶只有DNA末端连接蛋白存在时才能激活，Seki等从人胎脑cDNA文库中分离出该蛋白的全长cDNA，命名为激酶相互作用蛋白2(kinase interacting protein 2，KIP2），     

人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建

目的 构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库。方法 分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA，应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库；利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证，对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证。结果 所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆，随机挑选的100个阳性克隆中95％的均有长度在100—600bp的插入片段，cDNA斑点杂交验证显示27个(90．0％)克隆为阳性。结论 结合SMART cDNA合成技术，应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础。