胱天蛋白酶3介导BAG3蛋白剪切的研究

  目的 解析胱天蛋白酶（caspase）3介导BCL2结合抗凋亡基因3（BAG3）酶切的具体作用靶点,明确caspase 3裂解对BAG3抗凋亡作用的影响。方法 采用生物信息学方法筛选BAG3蛋白序列中潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点;采用定点突变法构建潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点突变体;体外翻译野生型和突变体BAG3蛋白;利用重组胱天蛋白酶caspase对野生型或突变型重组BAG3蛋白进行体外剪切实验;构建BAG3裂解片段的真核表达载体,突变型或片段BAG3表达载体转染SW1990细胞;利用Western blot检测各组细胞中BAG3蛋白的裂解情况;利用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率。结果 在BAG3蛋白序列中存在K344EVD347和L515EAD518 2个潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点;胱天蛋白酶caspase3可有效剪切D518A突变型BAG3,而不能剪切D347A突变型BAG3;D518A突变型和野生型BAG3同等程度抑制MG132诱导的细胞凋亡,D347A突变型BAG3对细胞凋亡的保护作用高于D518A突变型或野生型BAG3,而N末端和C末端剪切片段BAG3对MG132诱导的细胞凋亡无作用。结论 胱天蛋白酶caspase3主要在D347位点裂解BAG3蛋白;BAG3在D347位点的剪切使其丧失了原有的抗凋亡作用。     

TRAIL促人甲状腺癌细胞凋亡中一氧化氮作用的探讨

目的:探讨一氧化氮(NO)在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人甲状腺癌细胞凋亡中的作用。方法:S-亚硝基化生物素转化法、一氧化氮合酶(NOS)活性及NO产物测定法检测各组细胞3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)S-亚硝基化与NO产物关系;蛋白质印迹法检测各组细胞及细胞核中GAPDH蛋白表达;台盼蓝染色、DNA裂解分析、Caspase-3活性测定法检测各组FRO细胞凋亡。结果:20ng/mLTRAIL处理FRO细胞0～24h,可见NOS活性及作为NO氧化产物的硝酸盐和亚硝酸盐水平呈时间依赖性增加,于4h开始显著增高,P=0.008;12h达高峰。iNOS抑制剂L-NAME抑制TRAIL诱导的GAPDHS-亚硝基化及其随后的细胞核转位,但不影响TRAIL诱导的GAPDH表达。L-NAME显著抑制TRAIL诱导的人甲状腺癌细胞凋亡和Caspase-3活性,P值均<0.001。结论:NO介导的GAPDHS-亚硝基化修饰和随后的细胞核转位可能参与了TRAIL诱导的人甲状腺癌细胞凋亡。     

内质网应激与肿瘤

内质网广泛存在于真核细胞中,是蛋白质折叠、组装以及细胞内钙离子储存的场所,各种原因导致的未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内积聚或细胞内钙稳态失衡,都会引起内质网应激。细胞为了适应内质网应激的发生,在进化过程中形成了高度保守的自我保护的信号转导通路,称为未折叠蛋白反应。内质网应激和未折叠蛋白反应与许多疾病的发生都有关系,如糖尿病、缺氧条件下的肿瘤、神经退行性疾病和脑缺血等。本文主要介绍了内质网应激和未折叠蛋白反应在肿瘤发生中的作用,为肿瘤治疗提供了新的方向。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肿瘤细胞PRDXs表达影响的观察

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对肿瘤细胞中过氧化氧化还原蛋白(PRDXs)表达的影响及其机制。方法:选取肿瘤细胞,设立对照组和TRAIL处理组;用实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测PRDXs在各种肿瘤细胞中的表达;用PCR法克隆PRDX4启动子,用萤光素酶含量测定其含量。结果:与对照组相比,TRAIL处理组中PRDX1、PRDX2、PRDX3、PRDX5和PRDX6mRNA及蛋白表达差异无统计学意义,P>0.05;PRDX4mRNA和蛋白的表达显著降低,P<0.01;放线菌素D处理8h时,TRAIL处理组与对照组中PRDX4mRNA降解近50%,差异无统计学意义,P>0.05;TRAIL显著降低pPRDX4/-979的活性呈剂量依赖方式。结论:TRAIL在转录水平上下调肿瘤细胞中PRDX4基因的表达,对PRDX4mRNA的稳定性没有影响。     

衣霉素联合TRAIL促甲状腺癌细胞凋亡机制的研究

.TRAIL与衣霉素单用对甲状腺癌细胞均无明显杀伤作用,最高凋亡细胞比率分别为10.68%和10.14%;衣霉素与TRAIL联合组凋亡细胞比率最大达60.5%;但在存活素过表达甲状腺未分化癌ARO细胞中,凋亡细胞比率降低50%左右.结论:在体外单用TRAIL对甲状腺癌细胞增殖无明显抑制作用,衣霉素明显增加肿瘤细胞对TRAIL敏感性,其增敏机制至少部分与下调存活素水平有关.     

Bcl-2相关抗凋亡基因3对蛋白酶体抑制剂抗肿瘤作用影响的观察

目的:探讨Bcl-2相关抗凋亡基因3(Bcl-2-associated athanogene 3, BAG3)在蛋白酶体抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡中的作用.方法: 选取不同组织来源的人肿瘤细胞系,分别设空白对照组、蛋白酶体抑制剂MG132处理组、衣霉素处理组及特异性siBAG3、随机序列核酸siRNA和错位型siBAG3组;利用实时定量RT-PCR法检测各组细胞BAG3及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78) mRNA表达;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果:与空白对照组相比,MG132能显著增加有关细胞BAG3基因表达水平(P<0.01);而衣霉素处理组细胞BAG3表达变化差异无统计学意义,P>0.05,但明显增加GRP78表达(P<0.01);siBAG3组细胞BAG3表达水平显著低于随机序列核酸siRNA和simutBAG3组(P<0.01),siBAG3组细胞凋亡率差异有统计学意义 ,P<0.01.结论:BAG3是影响蛋白酶体抑制剂凋亡效应的一类破坏因子,下调其表达有望增加蛋白酶体抑制剂抗肿瘤活性.     

混合式教学法在本科生生物化学教学中的应用

目的坚持"以本为本"为核心,在生物化学教学中,充分活跃课堂气氛,激发学生的学习兴趣,提高学生的学习自主性,逐渐建立意义建构的思维模式,提高教学效果。方法采用临床病例导课法、以问题为导向的教学方法(PBL)与以授课为基础的教学方法(LBL)双轨教学法、"雨课堂"及思维导图归纳法等教学方法,并采用终结性评价与形成性评价相结合的考核方式。结果混合式教学方法使课堂教学形式多样化、丰富化,并且能够提高学生的学习自主性,引导应试教育的灌输式记忆模式向意义建构的自主思维模式转变,将课堂以传授知识为核心转变为注重学习能力的培养。结论混合式教学法能够提高学生的学习自主性与学习兴趣,构建自己的知识体系,为临床课程的学习打下扎实的基础。     

BAG3(WT)与BAG3(ΔPXXP)真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建重组人BAG3(WT)与BAG3(ΔPXXP)的真核表达载体,建立稳定表达EGFP-BAG3(WT)、EGFP-BAG3(ΔPXXP)的人甲状腺癌FRO细胞系。方法:基因克隆方法构建pcDNA3-N-EGFP-BAG3(WT)和pcDNA3-N-EGFP-BAG3(ΔPXXP)的真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将重组质粒导入FRO细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系。FRO细胞中EGFP-BAG3(WT)、EGFP-BAG3(ΔPXXP)的表达用倒置荧光显微镜方法检测。结果:分别成功构建pcDNA3-N-EGFP-BAG3(WT)和pcDNA3-N-EGFP-BAG3(ΔPXXP)重组质粒,获得转染并经G418反复筛选的稳定表达EGFP-BAG3(WT)、EGFP-BAG3(ΔPXXP)的FRO细胞系。FRO细胞均能表达绿色荧光,EGFP-BAG3(WT)主要分布在细胞质内,而EGFP-BAG3(ΔPXXP)在细胞质和细胞核内均有分布。结论:成功构建了BAG3(WT)与BAG3(ΔPXXP)真核表达载体。     

GRP78在蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌细胞凋亡中的作用.方法:对2种人甲状腺未分化癌细胞系FRO、AR0分别设空白对照组和蛋白酶体抑制荆处理组;及siGRP78、随机序列核酸siRNA和错位型siGRP78组.利用蛋白酶体抑制荆MG132(1μtmol/L)、PSI(10 nmol/L)和EPOX(5 nmol/L)作用2种细胞系,实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞GRP78 mRNA、蛋白表达.流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:蛋白酶体抑制剂处理24 h后,2种细胞系中GRP78mRNA及蛋白水平保持相似增长高峰,为空白对照组2～3倍(P<0.01);siGRP78转染24 h,细胞总GRP78 mRNA丢失>80%,转染48 h,GRP78蛋白总量丢失>75%.蛋白酶体抑制剂MG132作用后,ARO、FRO细胞凋亡率分别为8.3%和78.3%;当siGRP78靶向沉默GRP78后,蛋白酶体抑制剂诱导2种细胞凋亡率显著增加,AR0细胞凋亡率提高5倍左右(P<0.01).结论:2种甲状腺癌细胞系存在GRP78基因表达,不同程度干扰蛋白酶体抑制荆凋亡诱导作用;沉默GRP78基因表达可提高蛋白酶体抑制荆对肿瘤细胞杀伤率.     

蛋白酶体抑制剂对甲状腺未分化癌细胞ATF-4表达影响的研究

目的：探讨蛋白酶体抑制剂对甲状腺未分化癌FRO细胞中活化转录因子4（ATF-4）表达的影响,以及ATF-4在蛋白酶体抑制剂诱导FRO细胞凋亡中的作用。方法：选取人甲状腺未分化癌细胞系FRO,分别设空白对照纽和蛋白酶体抑制剂MG132处理组;利用微小RNA干扰技术,减少ATF-4的表达,实时定量PCR法、蛋白质印迹法分别检测各组细胞中ATF-4、氧调节蛋白150（ORP150）mRNA和蛋白表达;流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡。结果：与空白对照组相比,蛋白酶体抑制剂MG132显著增加FRO细胞系中ATF-4基因表达水平,P〈0．01;与空白对照组和随机序列核酸siRNA组相比,siATF-4处理组中ATF-4、ORP150mRNA及蛋白表达水平显著降低（P〈0．01）,其凋亡率显著增加,P〈0．01。结论：蛋白酶体抑制剂能够上调甲状腺未分化癌FRO细胞系中ATF4基因的表达水平,siATF-4具有降低ATF-4及OPR150基因表达的作用,同时增加蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺未分化癌FRO细胞的凋亡作用。