大肠埃希菌中共存两种携带ampC和/或超广谱β-内酰胺酶基因的质粒

目的：探讨从临床分离的大肠埃希菌（E．coli）中，由质粒编码的ampC和／或超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的基因质粒携带方式。方法：三维实验证实产AmpC酶的42株E．coli，用E．coliC600作为接合受体菌，采用头孢曲松和头孢他啶／头孢噻肟／棒酸两步淘筛法，进行对第三代头孢菌素耐药性的传递实验：用PCR法扩增质粒编码的ampC和ESBLs基因、三维酶实验和抗生素敏感实验对供体菌和接合子进行对比。结果：接合实验显示，有37侏供体菌对第三代头孢菌素的耐药性可传递，传递频率为10^-7～10^-5。其中23株菌仅传递了ESBLs耐药性，3株菌仅传递AmpC耐药性，11株菌传递了AmpC／ESBLs两种耐药性11株菌中，7株菌的AmpC／ESBLs耐药性携带在同一质粒上；另有4株菌各得到两种接合子，其中2株均得到携带ESBL耐药性和AmpC／ESBLs耐药性的2类接合子，2株均得到携带AmpC耐药性和ESBL耐药性的2类接合子结论：在同时表达AmpC和ESBLs两种酶的E．coli中，有些菌不能通过接合传递实验将两种耐药性分开传递，有些可分开传递。当AmpC和／或ESBLs耐药性基因在同一细菌中南2个质粒携带时，可在接合实验中得到两种不同的接合子。     

高产AmpC酶大肠埃希菌ampC基因启动区突变的分析研究

目的分析临床分离的高产AmpC酶大肠埃希菌(E.coli)中染色体ampC基因启动区突变状况。方法选择三维酶试验产AmpC酶和/或产ESBLs以及头孢西丁耐药的40株E.coli,用聚合酶链反应(PCR)扩增质粒型ampC基因和ampC基因启动区的片段,启动区扩增产物用MaeⅢ内切酶酶切。参考以上结果,选择部分菌株的启动区扩增产物测序分析。结果40株菌中,12株MaeⅢ酶不能切开启动子的-35区。21株被测序菌中,5株酶切异常的菌株,在-35区均出现-32位上T→A突变;11株在衰减区出现突变,主要突变点分布在 22位、 26位、 27位和 32位;3株出现-42、-18、-1和 584个位点突变,-42位C→T突变形成了与-35区强启动子相同的6位体序列。结论-42位、-32位和衰减区茎环位点的突变增强ampC基因的转录,在大肠埃希菌对广谱头孢菌素类药物耐药中起重要作用。     

铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制的研究

目的：研究铜绿假单胞菌（PA）对亚胺培南的耐药机制，为临床合理选择抗生素提供确切的依据。方法：用2-巯基丙酸和头孢他啶双纸片协同法，检测临床分离的48株耐亚胺培南PA金属β-内酰胺酶（MBL）产生率，并提取各菌株的外膜蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析，比较各耐药菌株外膜蛋白与标准菌株的差异。结果：48株耐亚胺培南PA中8株产MBL；在外膜蛋白SDS-PAGE图上发现32株缺少外膜蛋白OprD2，其中8株还伴随其他外膜蛋白的改变。结论：PA对亚胺培南耐药的主要原因是外膜蛋白OprD2缺失或含量减少以及MBL的产生，或由两者共同作用所致。     

大肠埃希菌高产AmpC酶的研究进展

大肠埃希菌（E.coli）中的ampC基因与其他革兰阴性细菌不同，染色体上的ampC基因启动子与延胡索酸还原酶（frdABCD）操纵子中的frdD基因重叠，衰减子是延胡索酸还原酶操纵子的转录终止子，缺少ampC调节基因ampR，所以携带野生型基因的Ecoli AmpC酶的产量非常低，临床意义不大。但近年来出现了高产AmpC酶的Ecoli，对其进行研究发现，ampC基因启动子、衰减子或ampC编码区的突变，或从其他细菌获得强启动子或携带强启动子的序列插入，或从其他细菌获得调节基因ampR等都可能导致染色体型AmpC酶的高产。质粒型ampC基因在Ecoli中的出现是AmpC酶高产的另一重要原因。     

肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶及相关表型研究

目的 证实临床分离的部分肺炎克雷伯菌（Kp）除产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）外，还同时产AmpC酶，并探讨了AmpC酶编码基因存在方式。方法 对临床分离的可疑同时产ESBLs和其他高活性广谱β内酰胺酶的8株Kp进行接合试验，并对供体菌和接合子同时采用三维试验、ESBLs试验、AmpC酶诱导试验和β内酰胺类抗生素最低抑菌浓度（MIC）试验测定，并进行AmpC基因携带状态、表达方式和酶活性分析。结果 8株Kp菌通过接合试验共得到10株接合子，其中有6株供体菌均只得到同时表达AmpC和ESBLs的1种接合子；另2株供体菌，各得2株接合子，1株同时表达AmpC和ESBLs，1株仅表达ESBLs；8株供体菌均未得到单独表达AmpC的接合子。表达AmpC接合子的耐药表型与受体菌非常接近，酶的活性也必须用克拉维酸（CA）和邻氯西林（CLO）两种酶抑制剂才能完全抑制，其中有5株可被头孢西丁（FOX）诱导使某些指示药出现截平现象。结论 在Kp中，已出现质粒携带的AmpC基因，有可能与编码ESBLs的基因存在于同一质粒上，并具有诱导型和非诱导型两种表达形式。     

男性泌尿系统感染产超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶的大肠埃希菌基因分型研究

目的:了解本院男性泌尿系感染产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶大肠埃希菌(E.coli)的基因型分布。方法:收集2004年1月~2005年6月本院临床分离的尿培养阳性大肠埃希菌共187株,用CLSI/NCCLS推荐的纸片扩散法(包括筛选和确认实验)进行耐药表型检测,三维酶试验检测ESBLs和AmpC酶,PCR扩增质粒型ESBLs和ampC基因,肉汤交配法检测质粒型ampC基因的接合传递性。结果:产ESBLs大肠埃希菌检出率为24.6%(46/187)。在三维试验中,46株均产分解头孢三嗪(CRO)的β-内酰胺酶,其中3株产ESBLs和AmpC两种酶,其余43株单产ESBLs酶。在PCR扩增试验中,44株扩增出ESBLs基因b laTEM、b laCTX-M、b laOXA3型中的1型或1型以上基因片段,未扩增出b laSHV型基因片段;3株扩增出质粒介导的ampC基因,2株为C IT型,1株为DHA型。携带质粒型ampC基因的菌株均将耐药性传递给受体菌。结论:南京地区男性泌尿系感染产ESBLs大肠埃希菌以CTX-M型为主;质粒介导AmpC酶已在大肠埃希菌中出现,其耐药性能够水平传播,给临床抗感染治疗带来严重威胁。     

舒巴坦单剂及舒巴坦与第三代头孢菌素联合对鲍曼不动杆菌的体外抗菌作用比较

目的比较舒巴坦（SB）单剂和舒巴坦联合第三代头孢菌素对鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性，探讨舒巴坦在联合制剂中的实际作用。方法从临床分离的表型为对头孢哌酮（CPZ）、头孢他啶（CAZ）和头孢噻肟（CTX）3种第三代头孢菌素中1种以上耐药或中介的56株鲍曼不动杆菌分为3组。A组（27株）对上述2种以上药物耐药；B组（11株）仅对CPZ耐药；C组（18株）仅对CPZ或CTX中介。采用微量肉汤稀释法检测sB单剂以及SB分别联合上述3种第三代头孢菌素敏感和耐药折点浓度的最低抑菌浓度（MICs）。采用CPZ三维酶提取和抑制试验检测β-内酰胺酶，并选择对CPZ中介（A株）和耐药（B株）进行杀菌曲线试验。结果SB对B组和C组菌的MICs≤1μg／ml；SB对A组菌的MICs范围在4～64μg／ml之间，并且与CPZ、CAZ或CTX任一药物的敏感和耐药折点浓度联合，均不能使联合后SB的MICs低于单剂SB的MICs。在三维β-内酰胺酶抑制试验中，酶活性不能被SB抑制的菌株，其SB的MICs值高于酶活性能被SB抑制的菌株。杀菌曲线显示在SB和CPZ之间无协同作用。结论SB单剂对多重耐药的鲍曼不动杆菌有抗菌活性，这些菌株对联合制剂的敏感可能主要是SB在发挥杀菌作用。     

多重PCR技术检测肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶基因

目的 建立多重PCR技术检测肺炎克雷伯菌（K.pneu）中质粒型ampC基因。方法 收集临床分离的表型可疑为产AmpC酶的24株K.pneu,用ampC基因的5群6个亚型的引物进行多重聚合酶链反应（mul—PCR）,用三维酶抑制试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和AmpC酶,结合mul—PCR、三维酶抑制试验和表型试验进行基因和表型分析。同时选择4株菌（3株ampC基因阳性,1株阴性）进行转质粒试验,以证实质粒型基因的存在。结果 在mul—PCR试验中,有22株扩增出C4族中长度405bp的片段,1株扩增出C-1族中长度462bp的片段;1株未扩增出目的条带。三维酶抑制试验中,24株菌中有19株菌未检出AmpC酶,但药物敏感试验中有诱导耐药现象,符合C4（DHA）族基因诱导表达的特性。转质粒试验中,3株ampC基因阳性的供体菌均将其ampC基因转入受体菌。结论 采用多重PCR技术可以简化质粒型ampC基因的检测方法。在我院临床分离的K.pneu中,出现质粒编码的AmpC酶,以C-4族基因为主要流行型。     

增加头孢吡肟、头孢吡肟-克拉维酸的双纸片试验在肠杆菌科细菌中检测ESBLs的探讨

目的探讨在产AmpC酶细菌中检测ESBLs的方法。方法临床分离对头孢西丁和第三代头孢菌素耐药和（或）中介的111株细菌用于本研究，包括47株阴沟肠杆菌、24株肺炎克雷伯菌和40株大肠埃希菌。结合三维酶抑制试验，ESBLs基因和质粒型ampC基因PCR扩增试验结果对改进法，包括CLSI推荐的ESBLs确认法中的2对纸片（推荐法）和头孢吡肟、头孢吡肟克拉维酸纸片法进行评估。结果47株阴沟肠杆菌中，推荐法22株ESBLs阳性，改进法32株阳性。24株肺炎克雷伯菌中，推荐法18株ESBLs阳性或可疑阳性，改进法21株阳性。40株大肠埃希菌中，推荐法26株ESBLs阳性，改进法34株阳性。三维酶抑制试验、ESBL和ampC基因的扩增试验结果证实AmpC酶的存在干扰了推荐法ESBLs的检出率。结论在NCCLS推荐的确认试验中增加头孢吡肟、头孢吡肟一克拉维酸纸片不仅可以提高ESBLs阳性检出率，而且是一种简易有效的方法，可以在临床微生物实验室的常规敏感试验中同时检测肠杆菌科细菌的ESBLs，也可在一定程度上推测AmpC酶的存在。     

大肠埃希菌中AmpC酶和质粒介导的ampC基因的发生和检测

目的从临床分离的大肠埃希菌(E.coli)中检测AmpC酶及质粒介导的ampC基因。方法选择从临床分离的可疑产ESBLs和AmpC 2种酶的40株大肠埃希菌,用NCCLS推荐的微量肉汤稀释法检测耐药表型,三维酶试验检测AmpC酶和ES-BLs,PCR扩增质粒型ampC基因和ESBLs基因,肉汤交配法检测质粒型ampC基因的接合传递性。结果在三维试验中,40株菌中有39株产β-内酰胺酶,其中21株产ESBLs和AmpC 2种酶,15株单产ESBLs,3株单产AmpC酶。在PCR扩增试验中,8株扩增出质粒介导的ampC基因,7株为C IT型,1株为DHA型;34株扩增出b laTEM、b laCTX-M、b laOXA 3型ESBLs基因中的至少1个型,未扩增出b laSHV。8株携带质粒型ampC基因的菌株,共筛选出9株接合子。结论AmpC酶已在我院的大肠埃希菌中出现,由质粒编码的AmpC酶可在细菌间传递。