体外反搏治疗血清对培养内皮细胞基因表达的影响

目的探讨经体外反搏治疗的冠心病患者血清对血管内皮细胞基因表达的调控效应。方法分别取接受体外反搏治疗的冠心病患者1、24和36h时间点的血清，用于培养人脐静脉血管内皮细胞。用cDNA基因芯片检测3个治疗时点反搏前、后血管内皮细胞基因表达谱。结果反搏前后比较，有10个基因（核转录因子、真核转录启动因子-4、平滑肌的肌球蛋白重链、α2-肌动蛋白、微管蛋白β肽链、组织相容蛋白G、黑色素黏附分子、神经介素B受体、蛋白激酶4K2、血小板凝血酶敏感蛋白-1）的表达在3个治疗时点上出现显著改变。在1h点均为上调，在24h、36h时点均为下调。结论体外反搏治疗冠心病患者血清对血管内皮细胞的炎症反应、细胞凋亡相关基因表达有调效应，并随体外反搏治疗时间的增加早抑制其表达的趋势。     

EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。本实验首次将ＥＢＶ－ＤＮＡ酶全基因片段克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２１上获得成功     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

hIL-2分泌肽序列在HepG2细胞中对hEndostatin表达和分泌差异的影响

目的:了解分泌肽序列在HepG2细胞中对人内皮抑素基因(hEndostatin)的cDNA表达和分泌差异的影响。方法:构建不含hIL-2分泌肽序列的真核表达载体pBlast-hEndo质粒, 转染人的HepG2细胞株, 用RT-PCR的方法检测HepG2(pBlast-hIL2-hEndo), HepG2(pBlast-hEndo), HepG2(pBlast-Mcs)和HepG2中hEndostatin的mRNA表达水平, 及制备4种细胞的总蛋白和收集各自的培养上清, 进行Westernblot分析蛋白表达和分泌的差异。结果:发现HepG2(pBlast-hIL2-hEndo)中hEndostatin的mRNA的水平显著高于HepG2(pBlast-hEndo)。而仅在HepG2(pBlast-hIL-2-hEndo)的细胞总蛋白和上清, 及HepG2(pBlast-hEndo)的细胞总蛋白中检测到hEndostatin表达, 在其它各株细胞总蛋白及上清中, 未检测到hEndostatin。结论:hIL-2分泌肽序列能促进hEndostatin基因在HepG2细胞中表达及分泌。     

EB病毒BHRF1基因的克隆及其表达产物抑制细胞凋？…

目的 ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因克隆，其表达产物抑制ＣＨＯ细胞凋亡功能的研究。方法 以Ｂ９５－８细胞株ＥＢＶ ＤＮＡ为模板设计一对引物，采用ＰＣＲ技术扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个单酶切点ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ进行酶切鉴定。用引物上所引入的两个酶切位点ＮｃｏⅠ、ＳｃｌⅠ酶切目的基因后定向连接到ｐＢＶ２２１载体上，转入宿主菌ＤＨ５α经质粒抽提，单、双酶切鉴定，从所获克隆中筛选重组质粒克隆。温控诱导     

应用亲和磷酸蛋白质组学筛选氧化应激重塑型LPS通路的侯选信号分子

目的： 研究低剂量LPS刺激的Thp-1细胞在有或无H₂O₂预处理时磷酸化蛋白组的差异，以初步筛选氧化应激重塑型LPS通路中的新信号分子。方法： 使用PMA刺激Thp-1单核细胞36 h使之分化成为成熟的巨噬细胞，静息36 h后，先以等体积的培养基或100 μmol/L H₂O₂刺激1 h，再以培养基或10 μg/L LPS刺激 30 min。采用PMAC ( phosphoprotein metal affinity column)富集各组细胞的磷酸化蛋白质，经超滤除盐后进行二维凝胶电泳，比较LPS组和H₂O₂+LPS组的磷酸化蛋白图谱的差异，并挑选部分斑点进行质谱鉴定。结果： 相对于LPS组（仅用LPS刺激的细胞)，在H₂O₂+LPS组（LPS刺激前经H₂O₂提前处理的细胞)中，有29个磷酸化蛋白斑点在双向电泳图谱中表现出可重复的差异，其中，17个斑点发生了上调（包括新出现的斑点），12个发生了下调（包括消失的斑点）。我们已经鉴定出其中5个差异蛋白，这些蛋白参与多种多样的细胞过程例如蛋白质降解、信号转导和蛋白质折叠等。其中，在H₂O₂+LPS组中显著下调的proteasome beta-4亚基与LPS信号传递关系密切。结论： 亲和磷酸蛋白组学有效减少了高丰度的结构蛋白的干扰并增加了信号分子检出的可能性。上述５个蛋白尤其是proteasome beta-4亚基可能是氧化应激重塑型LPS通路的重要调节分子。     

告诉你一个真实的卵磷脂

卵磷脂风靡欧美,在美国其销量仅次于复合维生素和维生素E。在许多国家,卵磷脂已成为一种像维生素一样的营养补充剂,甚至作为佐餐食品,因此它被誉为“最伟大的营养师”、“天然的血液洁净剂”。那么,卵磷脂究竟是什么东西,它来自哪里,它是否真有“血管清道夫”、“保肝”、“健脑”、“养颜美容”等功效呢?为让更多的读者认识卵磷脂,我们特邀了几位专家,请他们——     

转内皮抑制素基因治疗大鼠角膜新生血管

目的:探讨转染内皮抑制素(Endostatin)基因对酸烧伤引起的大鼠角膜新生血管的基因治疗。方法:通过限制性内切酶酶切反应、聚合酶链式反应、DNA测序及用NCBIBLAST软件与基因库序列比较的方法进行鉴定,鉴定后在大肠杆菌中扩增,用质粒纯化试剂盒抽提纯化;用750g/L硝酸银和250g/L硝酸钾混合烧灼液制作大鼠角膜新生血管模型,用结膜下注射脂质体包裹的质粒pBlast- hEndostatin来进行体内基因治疗。结果:实验证实质粒pBlast-hEndostatin含有人endostatin基因。结膜下注射脂质体包裹的质粒Tel押029-82245172Email押IJO.2000@163.compBlast-hEndostatin对酸烧伤引起的炎症性角膜新生血管有明显抑制作用,术后6,10,15d对角膜新生血管面积的抑制率分别为37%,40%,43%;对角膜新生血管密度也有明显的抑制作用,抑制率达40%。对角膜新生血管长度和角膜炎症细胞没有明显抑制作用。角膜新生血管面积与角膜水肿、角膜混浊呈正相关。结论:用结膜下注射脂质体包裹的内皮抑制素基因可以部分抑制酸烧伤引起的大鼠角膜新生血管。其作用机制是转基因产生的内皮抑制素蛋白直接抑制角膜新生血管的形成,而不是通过抑制炎症反应来抑制角膜新生血管的形成。     

乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的表达及在乙型肝炎病毒表面抗体检测中的应用

目的　构建含有乙型肝炎病毒S基因的表达载体 ,在毕赤酵母中表达出高免疫反应性的重组乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)S蛋白 ,用以制备乙型肝炎表面抗体 (HBsAb)酶免试剂盒。 方法采用聚合酶链反应从含乙型肝炎病毒全基因序列 (adw)的质粒PHBV1中扩增出S基因 ,并将其插入pPICZB质粒。携带有S片段的pPICZB质粒转化毕赤酵母菌株KM71H ,甲醇诱导重组酵母细胞表达S蛋白。表达产物包被聚丙乙烯反应板 ,用酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测HBsAb。结果　酶切电泳及DNA测序证实乙型肝炎病毒S基因已正确克隆到表达载体中 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示HBsAg在毕赤酵母中表达 ;表达量约占总蛋白的 2 5 %～ 35 %。表达产物用ELISA测定效价达 1∶2 5 6 0 0 ;Westernblot显示与正常人血清无交叉反应 ;用纯化产物作为包被抗原对卫生部临床检验中心HBsAb质控物及血清标本进行检测 ,灵敏度达 10mIu/ml,特异性达 10 0 % ,重复性及线性良好 ,与国产商品试剂检测结果一致。结论　毕赤酵母表达系统高效表达出具有良好免疫反应性和特异性的HBsAg,可用于基因工程原材料的HBsAb酶免试剂盒的研制