重组戊型肝炎病毒P179-海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂的制备及其免疫效果

目的 制备吸附重组戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)P179抗原的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂,并观察其免疫效果。方法 乳化法制备海藻酸钠/壳聚糖微球,采用不同海藻酸钠浓度、混合乳化剂添加量、混合乳化剂亲水亲油平衡值设计正交试验,确定最佳制备工艺参数。将重组HEV P179抗原吸附在最佳工艺制备的微球表面,制备吸附重组HEV P179的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂,皮下多点免疫BALB/c小鼠,测定其诱导小鼠产生特异性IgG抗体的能力,与同剂量含弗氏佐剂的重组HEV P179免疫制剂对比。结果 经正交试验确定乳化最佳工艺参数为:海藻酸钠质量分数1%、混合乳化剂体积分数2%,混合乳化剂亲水亲油平衡值4。制备的微球平均粒径为6.73 μm(分布范围3.90~9.10 μm,方差1.78 μm),形态较为均一,透射电镜观察结果与双层球体及内部疏松多孔的微球结构特点相符。用此条件制备抗原质量浓度为500 μg/ml的混悬制剂,微球对抗原的吸附率为90.64%。免疫效果观察试验结果表明,皮下多点免疫试验中微球制剂诱导特异性IgG抗体的能力优于含弗氏佐剂抗原。结论 成功制备了吸附重组HEV P179的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂,且诱导产生特异性IgG抗体的能力优于含弗氏佐剂抗原,为其在新型实验动物超敏制剂中的应用奠定了基础。     

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.     

乙型肝炎病毒截短L蛋白的表达及其与S蛋白生物信息学对比分析北大核心CSCD

目的 分别构建乙型肝炎病毒截短L蛋白(NL蛋白)和M蛋白目的基因的真核表达质粒,并进行体外表达;运用生物信息学方法分析NL蛋白和S蛋白的生物信息学特征,对比预测分析NL蛋白与S蛋白的免疫原性。方法 以全长L蛋白目的基因为模板,PCR扩增NL蛋白基因和M蛋白基因,分别与根据pCHO1.0改造后的表达载体pCHO1.0-1和pCHO1.0new-1构建重组质粒,共转染CHO-S细胞进行蛋白表达并利用阴离子交换层析方法进行蛋白纯化。通过SDS-PAGE和Western blot分析纯化蛋白的纯度及活性,利用透射电镜观察VLPs形成情况。利用生物信息学软件ProtParam分析NL蛋白和S蛋白的理化性质,利用Signal P5.0 Service和TMPRED分析蛋白的信号肽和跨膜区,利用NPS@SOPMA和Swissmodel分别预测蛋白的二级结构和三级结构,利用IEDB Analysis Resource分析预测蛋白的可及性、亲水性、β转角和线性抗原表位。结果 构建的pCHO1.0-1-NL和pCHO1.0new-1-M重组质粒序列正确,表达蛋白纯化后的纯度可达85%,纯化蛋白可被抗-HBs抗血清识别。透射电镜观察显示形成直径约为22 nm的VLPs。经生物信息学比较分析,NL蛋白为疏水性蛋白,含有3个跨膜结构,无信号肽,二级结构主要为无规则卷曲,结构较为松散。与NL蛋白相比较,单纯S蛋白则含有4个跨膜区域,并含有信号肽。IEDB Analysis Resource预测NL蛋白抗原优势表位,其前S蛋白氨基酸区域较S蛋白含有更多的抗原优势表位。结论 成功构建含前S1和前S2共表达载体,并同时表达含乙型肝炎病毒NL、M和S蛋白的VLPs。生物信息学分析了乙型肝炎病毒抗原优势表位的理论集中区域,为研发含有前S蛋白的新一代乙肝疫苗奠定了基础。