iRhom2及其突变基因重组慢病毒的包装和稳定表达细胞系的建立

目的：通过重组慢病毒感染,建立iRhom2及其突变基因的Vero细胞稳定细胞表达系,用于iRhom2的功能研究。方法：将iRhom2 及其突变基因克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染Vero细胞,利用puromycin进行加压筛选,获得二者的重组表达细胞系。 结果：构建了iRhom2及其突变基因的逆转录病毒载体,并获得了重组逆转录病毒病毒,并利用该病毒获得了二者的稳定表达细胞系Western-blot实验证实,二者能够在Vero细胞内稳定表达。结论：利用重组逆转录病毒感染,成功获得了iRhom2及其突变系的Vero细胞稳定表达株,为进一步研究iRhom2的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列，并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的mRNA设计四条干扰序列，并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体，将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞，获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞，利用Puromycin进行筛选，获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示，四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果，但只有shNoggin-1（P<0.01）对其表达影响显著。Western Blot结果显示，四种干扰序列中只有shNoggin-1（P<0.01）对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论 获得了一种Noggin基因的干扰序列，该序列能够干扰Noggin基因mRNA的稳定性，从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因，从而用于研究Noggin基因的功能。     

Noggin基因沉默对BMP和Wnt信号通路表达的影响

目的 检测分析Noggin基因沉默对毛囊发育中BMP和Wnt信号通路的影响。方法 采用实时荧光定量PCR和Western Blot技术对Noggin基因沉默的MC3T3-E1稳转细胞系中BMP-2、BMP-4、BMPR-ⅠA、BMP-6、BMP-7、LEF-1、β-catenin的表达情况进行检测分析。 结果 实时荧光定量PCR结果显示,BMP信号通路中的五个基因的表达都受到Noggin基因沉默的显著的影响,其中BMP-2（P<0.001）、BMP-4（P<0.01）、BMP-6（P<0.001）、BMP-7（P<0.001）表达量均升高;BMPR-ⅠA（P<0.01）表达量降低。同时Wnt信号通路中的两个基因LEF-1（P<0.001）、β-catenin（P<0.001）的表达也都显著降低。Western Blot结果显示,两条信号通路中这几种蛋白的表达也都受到影响,其中显著升高的有BMP-2（P<0.05）、BMP-4（P<0.05）、BMP-6（P<0.05）和BMP-7（P<0.05）;显著降低的是β-catenin（P<0.05）、BMPR-ⅠA（P<0.01）和LEF-1（P<0.001）。结论 在体外Noggin基因对BMP信号通路可能存在反馈性抑制机制,而对Wnt信号通路存在反馈性激活机制,为下一步探究在体内Noggin基因对BMP和Wnt信号通路表达的作用提供一定的依据。     

猕猴B病毒gB蛋白胞外区基因片段的合成和真核表达

目的获得猕猴B病毒gB蛋白胞外区基因,并分析其表达特性。方法利用基因合成的方法合成B病毒gB蛋白胞外区的基因片段,经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接到pEGFP-N3载体。将构建的pEGFP-N3-GB合重组质粒转染到293细胞。提取蛋白用Western blot检测其在细胞内的表达情况,并利用激光共聚焦分析在细胞内的表达定位。结果 pEGFP-N3-GB合重组质粒能在293细胞内正常表达,并且在细胞膜上表达。结论利用真核表达系统,可以产生B病毒gB蛋白的特异性抗原重组蛋白,且在细胞膜上表达。     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的 探讨不同日龄封闭群新西兰白兔的血液学特性.方法 采集不同年龄、不同性别新西兰白兔的血液样品,应用全自动血细胞仪测定160只新西兰白兔的血液学指标.结果 各年龄段新西兰白兔血液学指标性别间无显著差异(P＞0.05),不同年龄段之间除单核细胞总数差异不显著(P＞0.05),其它指标有显著差异(P＜0.05).结论 本院培育自繁的实验型封闭群新西兰白兔生物学特性较稳定,个体间差异较小,初步建立了不同日龄新西兰白兔血液生理指标正常值,为新西兰白兔的广泛使用提供基础数据.