SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

口蹄疫病毒融合表位基因在原核及真核表达系统中的正确表达

目的:在体外检测口蹄疫病毒融合表位基因的表达。方法:计算机辅助设计(CAD)口蹄疫病毒融合表位基因SG,采用Western印迹分析和双抗体夹心ELISA法对该基因在原核系统和真核系统的表达进行检测。结果:得到不同表位组合的融合表达克隆,37℃培养2h后用IPTG诱导5h,融合蛋白在2×YT培养液中得到高效表达;全菌中相应蛋白条带与阳性抗体呈阳性反应,阳性反应强弱基本与表位特性及数量有关;得到4个P815细胞阳性克隆,培养上清、细胞膜和细胞质的抗原均为阳性,其中培养上清中浓度较低,细胞膜和细胞质中浓度较高。结论:CAD的融合表位基因在原核和真核系统均得到正确表达;CAD对于表位研究的设计很有帮助。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

钩端螺旋体DNA疫苗pcD-flaB在豚鼠体内的免疫保护性研究

目的观察钩端螺旋体DNA疫苗peD-flaB是否具有抗钩体交叉感染的保护作用。方法将纯化后的钩体DNA疫苗pcD-flaB100μg200μl肌肉注射豚鼠，共免疫2次，间隔7d，初次免疫后的第21天分别攻击感染赖型、临海型和波摩那型钩体，观察保护作用。结果该疫苗对3型钩体的保护率分别是88．89％、100％和100％，总保护率为96．3％，与对照组差异具有显著性。结论DNA疫苗pcD-flaB在豚鼠体内不但具有抗同型钩体(临海型)感染的作用，也具有较好的交叉保护作用。     

56609株钩体lipL32基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的初步表达

钩体病是一种临床表现多样的人兽共患疾病 ,致病性钩端螺旋体 (钩体 )根据交叉凝集反应被分为2 5个血清群和大约 2 5 0个血清型。如此多血清型的钩体所引起的临床症状和体征复杂多样 ,经常造成误诊而延误治疗。因此 ,建立一种简单、快捷、敏感、特异的诊断方法很有必要。钩体的诊断或依赖于检测血清中的抗体或检测组织或体液中的病原体。由于分离钩体不但困难而且费时 ,所以血清学的诊断是一种应用最广泛的方法。与经典的MAT等方法相比 ,ELISA方法具有简单、快捷、敏感、特异等优点 ,但是检测用抗原的选择是决定该方法特异性和敏感性的…     

口蹄疫病毒融合表位基因在pET原核系统的高表达及产物的纯化

构建口蹄疫融合表位基因-SG表达载体pET-SG,转化重组子与K802,新鲜过夜菌以2％接种量接种2YT培养液,37℃培养2 h后用IPTG诱导,每隔1 h取样,共8 h.根据SDS-PAGE结果,口蹄疫融合表位基因-SG在pET原核表达系统可获得较高表达,用IPTG诱导4 h蛋白表达量最高,用Ni+柱亲和层析可得到较纯蛋白.     

钩端螺旋体膜表面蛋白LipL41基因的克隆、序列分析及表达

目的:进一步分析钩端螺旋体LipL41的免疫原性.方法:通过PCR的方法,以我国特有的钩端螺旋体流感伤寒群临海型lin6株(56609)的DNA 为模板,扩增目的基因LipL41,克隆至pcDNA3载体上,以自动测序仪测序后进行序列分析,然后克隆至原核表达载体pGEX-5T进行原核表达,Western印迹分析其免疫原性.结果:获得长1 068 bp的片段,DNA序列分析表明该菌株的LipL41基因与文献报道具有很高的同源性(95.0％～99.4％),在大肠杆菌中获得了表达,并与抗钩端螺旋体血清反应.结论:该抗原为致病性钩端螺旋体所具有的保守性抗原成分,可能在钩端螺旋体病的诊断和预防中发挥作用.     

含三联密码AAA的Kozak类似序列特异性增强口蹄疫DNA疫苗的免疫效果

目的 引入6种不同的Kozak类似序列制备口蹄疫DNA疫苗,比较分析Kozak类似序列中不同碱基组成对口蹄疫DNA疫苗表达水平及免疫效果的影响作用.方法 在口蹄疫DNA疫苗抗原编码基因VP1起始位点引入Kozak通用序列及所设计的5种Kozak类似序列（KZ1-KZ6）,插入真核表达载体pVAX1,制备口蹄疫DNA疫苗,对6～8周龄BALB/c小鼠进行免疫,用间接ELJSA分析实验动物外周血VP1的抗体滴度;同时插入带有绿色荧光蛋白的融合表达载体pEGFP-N1构建6种体外表达质粒,转染HeLa细胞,进行瞬时表达并分析体外表达水平.结果 引入含三联密码AAA的Kozak类似序列KZ6的疫苗质粒pKV6接种动物后产生的免疫抗体滴度高于其他组;相应的体外表达质粒pKG6转染HeLa细胞后体外表达水平亦高于其他组.结论 含三联密码AAA的Kozak类似序列KZ6的口蹄疫DNA疫苗,能特异性地增强口蹄疫DNA疫苗的表达水平及免疫效果.     

猪囊尾蚴DNA疫苗在猪组织中的分布

目的：分析猪囊尾蚴DNA疫苗pcDNA3-cC1肌肉接种后在猪体内的组织分布。方法：分别于疫苗接种后1d、7d、4周、8周，提取猪骨髓、肾、肝、脑、性腺、肠系膜淋巴结、脾、胸`腺外周血及肌注部位的肌肉和皮肤的总DNA，通过PCR的方法检测疫苗质粒在各组织中的分布及随时间变化的情况。结果：疫苗接种后的第1天几乎所有组织中都检测到质粒；但随着时间的延续；仅在注射部位的肌肉和皮肤中检测到质粒的存在，并保持到8周以上。结论：肌注疫苗质粒后，实验猪组织中的游离质粒在短时期内就被清除。