血清乙型肝炎病毒DNA水平对HBV全基因组克隆效率的影响

目的：通过比较血清HBV DNA水平对一片段PCR法和两片段PCR法这两种不同方法的HBV全基因组克隆效率的影响，选择出合适的HBV全基因组克隆技术，供后续的HBV的基础和临床研究。 方法：采集了慢性乙型肝炎（CHB）患者85份血清，分别用本研究建立的一片段PCR法及两片段PCR法扩增HBV全基因组，经双酶切鉴定后将PCR产物克隆入载体，进行HBV全基因组序列测定。同时用实时荧光定量PCR法检测上述85份血清的HBV DNA滴度。 结果： 本研究建立的一片段PCR法扩增成功需要的血清HBV DNA浓度高于两片段PCR法,两种方法扩增的效率比较为：一片段PCR法扩增的阳性率低于两片段PCR法（P<0.01）。一片段PCR法的保真性和灵敏度分析发现： 保真性：核苷酸的人为突变率为1.13 bp/kb；灵敏度：为102个初始模板。浓度大于103的重组质粒DNA80%可以成功扩增，浓度低于该值的扩增效率比较低。结论： 血清HBV DNA水平对两种扩增方法的阳性率有一定影响，滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。HBV DNA滴度大于106copies/L的样本，可选用一片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术，而对HBV DNA滴度小于106copies/L样本，则可选用两片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术。本研究建立的一片段PCR法扩增HBV全基因组克隆的技术是一种值得推荐的好方法，但还需进一步优化。     

新型的抗线粒体抗体M2亚型IgG和IgA抗体的检测方法在原发性胆汁性肝硬化诊断中的价值

目的: 评价以新型天然M2抗原和BPO融合蛋白M2-3E(BPO)为靶抗原的 ELISA法(抗-M2-3E ELISA)检测抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2)IgG和IgA抗体在原发性胆汁化肝硬化(PBC)诊断中的敏感性、特异性。 方法: 分别用间接免疫荧光法(IFL)、以丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)为靶抗原的ELISA法(抗- PDC ELISA)、抗-M2-3E ELISA法检测107例PBC、31例自身免疫肝炎(AIH)、10例原发性硬化性胆管炎(PSC)、17例丙型病毒性肝炎(HCV)、29例乙型病毒性肝炎(HBV)患者和26例健康体检者。 结果: (1)107例PBC患者用IFL、抗-PDC ELISA和抗-M2-3E ELISA 3种方法检测AMA-M2 IgG的检出率分别为:87/107(81.3%)、78/107(72.9%)、97/107(90.6%)。特异性分别为98.1%、97.2%、98.3%。抗-M2-3E ELISA法AMA-M2 IgG的检出率(90.6%)显著高于IFL法(81.3%)和抗-PDC ELISA法(72.9%)(均P<0.01)。用抗-M2-3E ELISA法检测AMA-M2 IgA的检出率为59/107(55.1%),特异性为97.2%。而总体AMA-M2 IgG和/或IgA的检出率99/107(92.5%),特异性为95.2%。(2)IFL 和 抗-M2-3E ELISA的重叠度为85%,抗-M2-3E ELISA可以在超过一半的IFL阴性的患者中检出AMA-M2 IgG和/或IgA。 结论: 抗-M2-3E ELISA法具有比IFL和抗-PDC ELISA法更高的敏感性、特异性。但是,AMA-M2 IgG和IgA都不可以单独用于诊断PBC的标记。     

广州地区人腺病毒5型血清中和抗体阳性率初步调查

目的评估广州地区人群中人腺病毒5型(HAdV-5)中和抗体阳性率情况。方法采用以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的人重组腺病毒5型载体,运用化学发光法,检测209份免疫功能正常的成人血清样本中HAdV-5的中和抗体。结果 HAdV-5中和抗体的阳性率为82.3%(172/209)。HAdV-5中和抗体在<1:20(低滴度)、1:40-1:160(中滴度)、1:320-1:1280(高滴度)、>1:1280(超高滴度)时均能检测到,而且随着滴度的增加,阳性率逐渐升高。在20～40岁时HAdV-5中和抗体阳性率最高,在<20岁时HAdV-5阳性率最低。结论广州地区人群中针对HAdV-5的先存中和抗体阳性率高,应用基于该种DNA病毒作为载体进行基因疫苗及基因治疗的研究时,具有一定的局限性。     

自身抗体谱在原发性胆汁性肝硬化诊断中的作用

目的分析原发性胆汁化肝硬化（PBC）患者的自身抗体谱和免疫功能,探讨其对PBC的诊断价值。方法用免疫印迹法检测107例PBC、100例疾病对照组和30例健康体检者血清中的抗线粒体抗体（AMA）M2亚型、AMAM2—3E（BPO）、抗Spl00抗体、抗gp210抗体、抗肝肾微粒体1型（LKM一1）抗体、抗早幼粒细胞性白血病（PML）抗体、抗肝特异性胞质抗体-1（LC-1）、抗可溶性肝抗原,肝胰抗原抗体（SLA／LP）。结果1．AMA—M2、AMAM2—3E（BPO）、抗Spl00抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体对PBC诊断的敏感性、特异性分别为74．7％、90．2％,86．9％、95．1％,32．7％、97．1％。27．1％、97．5％,39．3％,98．3％。未检测到抗LKM-1抗体、抗LC～1抗体、抗SLA几P抗体。2．在118例疾病对照组中AMA—M2、AMAM2—3E（BPO）、抗Sp100抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体检出率分别为16％、11％、3％、1％、3％,未检测到抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA／LP抗体。在正常对照组上述8种抗体的检出率均为0。3．AMA—M2呈阳性的患者（n=97）比呈阴性的患者（n=lO）有更加严重的疾病。这可通过更加严重的组织学变化和更高的IgG,IgM和ALP平均值看出;抗gp210抗体呈阳性的患者肝功能衰竭发生率明显高于呈阴性的患者（P〈0．05）。结论PBC患者血清中可检测到多种自身抗体,其中抗Spl00抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体在PBC诊断中特异性高,可协助诊断PBC。     

通过生物信息学方法筛选和初步鉴定小鼠Trim30α的人同源基因

目的 通过生物信息学方法寻找小鼠Trim30α的人同源基因,观察候选人Trim蛋白对TAB2诱导的NFκB荧光素酶报告基因活化的影响. 方法 用MEGA4.0软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子进行进化树分析,用DNAMAN6.0软件对候选人Trim与小鼠Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律,以筛选出小鼠Trim30α的人同源基因,并将其构建成真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测其对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响. 结果 生物信息学分析显示,Trim30α与人Trim5α、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点；Tim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％; Trim22可以抑制TAB2诱导的NFκB报告基因的活化. 结论 Trim22对TAB2诱导的NFκB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.     

通过生物信息学方法筛选和初步鉴定小鼠Trim30α的人同源基因

目的通过生物信息学方法寻找小鼠Trim30α的人同源基因,观察候选人Trim蛋白对TAB2诱导的NFκB荧光素酶报告基因活化的影响。方法用MEGA4.0软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子进行进化树分析,用DNAMAN6.0软件对候选人Trim与小鼠Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律,以筛选出小鼠Trim30α的人同源基因,并将其构建成真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测其对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果生物信息学分析显示,Trim30α与人Trim5α、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点;Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51%、45.47%;Trim22可以抑制TAB2诱导的NFκB报告基因的活化。结论 Trim22对TAB2诱导的NFκB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能。     

自身抗体分析在慢性胆汁淤积性肝病鉴别诊断中的价值

目的分析多种自身抗体在慢性胆汁淤积性肝病鉴别诊断中的价值。方法选取186例慢性胆汁淤积性肝病的患者,包括107例原发性胆汁性肝硬化（PBC）、48例原发性硬化性胆管炎（PSC）、18例AMA阳性的自身免疫性肝炎（AIH）、13例其他肝内胆汁淤积患者,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测这些患者血清中传统的抗AMA-M2、抗AMA-M2-3E（BPO）IgG、抗AMA-M2-3E（BPO）IgA、抗gp210抗体、抗Sp100抗体、抗PML抗体、抗SLA/LP抗体、抗ACA抗体。结果 107例PBC患者抗M2-3E ELISA法AMA-M2 IgG的检出率为86.9%。在AMA-M2 IgG阳性病人中抗gp210和抗Sp100抗体明显高于抗PML抗体、抗SLA/LP抗体、抗ACA抗体差别具有统计学意义（P〈0.05）。27例AMA-M2阴性的PBC患者中有11例患者AMA-M2 IgG阳性,16例患者存在AMA-M2-3E IgG、抗Sp100抗体、抗gp210抗体1种或几种的组合。抗Sp100抗体、抗gp210抗体只在PBC患者和AMA阳性的自免疫性肝炎患者中被检测到,且抗gp210抗体出现在愈后差的患者中。结论 AMA和抗核抗体（ANA）检测在慢性胆汁淤积性肝病鉴别诊断中具有重要作用。     

广州地区猴腺病毒7型血清流行病学初步调查

目的评估广州地区猴腺病毒7型(SAdV-7)先存中和抗体阳性率情况。方法首先构建以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的猴重组腺病毒7型载体SAdV7-CMV-LacZ。然后使用化学发光法,检测209份免疫功能正常的成人的血清样本中SAdV-7中和抗体阳性率情况。结果我们发现SAdV-7中和抗体的阳性率为27.8%(58/209)。SAdV-7中和抗体在低滴度时阳性率最高,并且随着滴度的升高,阳性血清分布率逐渐降低。在20～40岁人群中,SAdV-7中和抗体阳性率最高,在<20岁人群中未检测到SAdV-7中和抗体。结论广州地区人群中针对SAdV-7的先存中和抗体阳性率低。因此,SAdV-7在基因治疗及基因疫苗的应用上是一个具有吸引力的候选载体。     

新型的抗线粒体抗体M2亚型抗体的检测方法在原发性胆汁性肝硬化诊断中的可靠性分析

目的研究以天然M2抗原和BPO融合蛋白M2-3E（BPO）为靶抗原的ELISA法（抗-M2-3EELISA）检测抗线粒体抗体M2亚型（AMA-M2）抗体在原发性胆汁化肝硬化（PBC）诊断中的可靠性。方法分别用间接免疫荧光法（IFL）、以丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）为靶抗原的ELISA法（抗-PDCELISA）、以三联体（BPO）为靶抗原的ELISA法（抗-3EELISA）、以天然M2抗原和BPO融合蛋白M2-3E（BPO）为靶抗原的ELISA法（抗-M2-3EELISA）检测107例PBC、167例疾病对照和30例正常对照血清中的AMA-M2抗体。结果107例PBC患者用抗-M2-3EELISA、抗-3EELISA、抗-PDCELISA和IFL4种方法检测AMA-M2的检出率（敏感性）分别为99/107（92.5%）、94/107（87.9%）、78/107（72.9%）、87/107（81.3%）,特异性分别为97.3%、98.5%、98.5%、97.3%。抗-M2-3EELISA法AMA-M2的检出率（92.5%）显著高于抗-PDCELISA法（72.9%）（P〈0.001）、IFL法（81.3%,P〈0.001）,高于抗-3EELISA（87．9％）。在20例IFL检测AMA—M2为阴性的PBC患者中,用抗-M2—3EELISA法AMA—M2的检出率为11／20（55％）。抗-M2-3EELISA和IFL的重叠度为85．0％（91／107）。结论抗-M2-3EELISA法具有比IFL、抗-PDCELISA法和抗-3EELISA更高的敏感性,特异性达97-3％。因此,抗-M2-3EELISA法可作为第一轮AMA-M2的筛查,但不可以单独用于诊断PBC的标记。