医学微生物学实验教学的体会

医学微生物学实验教学是理论教学的有益补充,也是医疗实践的前奏.实验课教学不同于理论教学,重在培养学生动手能力,该文围绕课前准备、课中安排、课后分析归纳等多个层面,重点阐述了如何上好一堂医学微生物学实验课的方法和切身体会.     

丙型肝炎病毒融合蛋白及融合机制

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）属于黄病毒科、肝病毒属,是有包膜的单正链RNA病毒,其包膜糖蛋白E1、E2均位于病毒颗粒外表面,主要参与子代病毒颗粒的形成（如组装）及病毒新一轮感染（如细胞黏附、受体结合以及膜融合等过程）。目前研究认为,有包膜病毒均通过一个共同机制--膜融合将自身基因组输送至靶细胞,然后进行复制、转录与翻译、子代病毒组装与释放。经受体结合[如Ⅰ型人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV-1）]、pH改变[如流感病毒、登革病毒（dengue virus,DENV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus,SFV）]或二者兼具（如鸟类肉瘤病毒、白血病病毒）的方式,与细胞膜或内体（endosome）膜发生融合[1]。本文将对近年来HCV E1、E2所介导的膜融合研究作一综述。     

HCV多表位长肽诱导的初次和记忆T细胞应答

全球有超过1．7亿HCV感染者，其中约80%的感染者可能发展为慢性感染。研究提示，增加靶向多个表位的多重特异性T细胞应答有利于清除病毒和防止病毒逃逸。法国Fournillier等合成了选自HCV非结构蛋白NS3、NS4、NSSB的4个多表位长肽A、B、C、D，4个长肽中均含最小HLA—A2限制性表位，A肽中还有1个HLAⅡ类表位。用代表HLA—A2最小表位的多肽或多表位长肽免疫6～8周龄HLA～A2．1转基因小鼠，通过CTL试验检测小鼠体内多表位长肽诱导特异性CTL的能力。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2核衣壳蛋白原核表达、纯化及其抗血清制备

目的 表达并纯化重组的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核衣壳（N）蛋白,通过免疫小鼠制备SARS-CoV-2 N蛋白抗血清。方法 将含有SARS-CoV-2 N基因的pET28a-N原核表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化SARS-CoV-2 N重组蛋白;将SARS-CoV-2 N重组蛋白联合锰佐剂通过肌内和皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,获得抗血清;用蛋白质印迹分析检测SARS-CoV-2 N重组蛋白与SARS-CoV-2 N单克隆抗体及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）N多克隆抗体的反应;用间接免疫荧光实验检测小鼠抗血清与真核表达质粒转染细胞中SARS-CoV-2 N重组蛋白的反应。结果 成功诱导大肠杆菌表达出可溶性的SARS-CoV-2 N重组蛋白,相对分子质量约为55 000,纯化出该重组蛋白;蛋白质印迹分析结果显示SARS-CoV-2 N重组蛋白能与SARS-CoV-2 N单克隆抗体及SARS-CoV N多克隆抗体结合;间接免疫荧光实验检测结果表明制备的小鼠抗血清能与哺乳动物细胞中表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白结合。结论 成功表达、纯化出SARS-CoV-2 N重组蛋白,并制备出该蛋白的小鼠抗血清,为后续建立SARS-CoV-2的快速诊断方法及开展SARS-CoV-2 N蛋白的功能研究奠定了基础。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2主要蛋白质分子的氨基酸变异分析

目的 应用生物物理学方法鉴定分析严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）中主要蛋白质分子的关键氨基酸变异。方法 通过氨基酸序列同源比对、突变氨基酸残基分类、蛋白质三维结构重建和氨基酸残基静电相互作用测量,以同源性最高的蝙蝠冠状病毒RaTG13为参照,进行SARS-CoV-2中主要蛋白质分子的关键氨基酸变异分析。结果 初步分析确定SARS-CoV-2中RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、核糖核酸外切酶（ExoN）、尿苷酸特异性核糖核酸内切酶（NendoU）和刺突蛋白（S蛋白）上至少发生了10处影响静电相互作用的氨基酸变异,这些变异可能影响蛋白质分子的空间构象及其生物学功能。结论 初步确定了SARS-CoV-2中主要蛋白质分子的关键氨基酸变异,为理解SARS-CoV-2的遗传特性、致病性和流行病学特征提供了有用线索。     

SARS在香港流行

本文报道了自2003年3月11～25日入住香港威尔士亲王医院(the Prince of Wales Hospital)的138例疑似SAPS病例的临床、实验和影像学特征。 该批患者中66名男性,72名女性,其中69名为医护人员,平均年龄为39.3±16.8岁。潜伏期为2～16天,共同的临床症状包括发热(>38℃,100％)、     

SARS-CoV核衣壳蛋白抗原性鉴定和基因免疫研究

目的　了解SARS冠状病毒 (SARS CoV)核衣壳蛋白 (N蛋白 )的抗原性及其基因疫苗的免疫原性。方法　用大肠杆菌表达SARS CoV的N蛋白 ,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定。再构建N蛋白基因疫苗 ,肌肉注射接种小鼠 ,检测小鼠血清中的抗N蛋白IgG抗体、脾细胞增殖和迟发型超敏反应。结果　大肠杆菌重组表达的SARS CoVN蛋白具有强抗原性 ,其基因疫苗能在小鼠有效诱导N蛋白特异性抗体和CD4 、CD8 T淋巴细胞免疫应答。结论　SARS CoV的N蛋白可作为重要的SARS血清学诊断抗原 ,并对于SARS的特异性预防和治疗有潜在的应用价值。     

基于仓鼠模型的新型冠状病毒抗体依赖性感染增强研究

目的   利用仓鼠模型探究新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染后是否存在抗体依赖性感染增强（antibody-dependent enhancement,ADE）现象,为疫苗研发和接种提供实验依据。方法   实验室构建SARS-CoV-2感染仓鼠模型,分成对照组、感染组、二次感染组、免疫组,ELISA法检测仓鼠血清总抗体以及细胞因子IL-6和转化生长因子-β含量;中和试验法检测仓鼠血清病毒中和抗体;免疫印迹法和定量逆转录PCR检测仓鼠肺组织病毒含量;苏木精-伊红染色法观察仓鼠肺组织病理变化;分离培养仓鼠腹腔原代巨噬细胞,检测仓鼠免疫血清能否促进SARS-CoV-2对巨噬细胞的感染。结果   二次感染组和免疫组仓鼠血清总抗体滴度差异无统计学意义（P>0.05）;但免疫组中和抗体水平显著低于二次感染组（P<0.001）;与感染组相比,二次感染组和免疫组仓鼠感染病毒后体质量保持稳定（P<0.01）,肺组织炎症反应轻,仅免疫组在感染后第2天的肺组织中检出病毒;各组仓鼠血清中促炎因子IL-6和抗炎因子转化生长因子-β的含量差异无统计学意义（P>0.05）;在有或无仓鼠免疫血清的条件下,SARS-CoV-2均不能感染仓鼠腹腔巨噬细胞,但可被吞噬。结论   基于仓鼠感染模型的初步实验结果,不支持SARS-CoV-2感染中存在巨噬细胞介导的ADE现象。     

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达简

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原（HBs）嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCVAR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H—AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV—HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-s真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCVAR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24HAR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA—AR3-S构建正确,Westernblot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H—AR3和pCMV—HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。