全反式维甲酸通过内质网应激诱导N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V受阻的人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的初步探讨全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）诱导N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V（N—acetylglucosaminyltransferase V，GnT—V）表达受阻的人肝癌SMMC-7721细胞（AsGnT—V／SMMC-7721）发生凋亡与细胞中内质网应激的关系。方法利用RT-PCR检测ATRA处理前后AsGnT-V／SMMC-7721细胞中内质网应激关键分子GRP78（glucose regulated protein 78）、XBP1（X box binding protein 1）等的变化。并用Western blot检测ATRA处理前后AsGnT—V／SMMC-7721细胞中内质网应激相关凋亡途径中的重要分子CHOP（C／EBP homologus protein）、caspase-9、caspase-12以及caspase-3的变化。结果GRP78和XBP1的变化表明经ATRA处理后AsGnT-V／SMMC-7721细胞的内质网应激加剧了，而与内质网应激相关的凋亡分子CHOP、caspase-9、caspase-12以及caspase-3都发生了激活。结论ATRA诱导AsGnT—V／SMMC-7721细胞发生的凋亡与内质网应激有关。     

内质网驻留的分子伴侣与内质网应激的细胞内信号传导途径

内质网(endoplasmic reticulum,ER)和高尔基体(Golgi complex)是多数细胞内、细胞表面和细胞外蛋白质合成、加工和转运的主要场所.蛋白的合成从转录水平开始,经过翻译形成原始的肽链.     

N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达下调可通过GLUT1的糖基化改变和活性下降引起人肝癌SMMC-7721细胞内质网应激

目的初步探讨N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V（GnT-V）表达下调的人肝癌细胞SMMC-7721中引起内质网应激的机制。方法利用RT-PCR检测SMMC-7721（以下简称7721）细胞中葡萄糖转运蛋白（GLUT）的表达情况，利用Westernblot、免疫沉淀及凝集素印迹分析检测转染了反义GnT-V的SMMC-7721细胞（以下简称As／7721）以及转染空质粒pcDNA3的SMMC-7721细胞（以下简称Mock／7721）中GLUTl的N-糖链变化，利用葡萄糖摄取率分析来检测以上3种细胞中GLUT1葡萄糖转运活性的变化。结果在As／7721细胞中GLUTl的N-糖链糖基化水平较Mock／7721明显下降，而且其GLUT1的葡萄糖转运活性也较Mock／7721细胞明显下降。结论葡萄糖转运蛋白GLUT1N-糖基化的改变和转运活性的下降可能是GnT-V表达下调的SMMC-7721细胞中引起内质网应激的机制之一。     

病理性近视的基因位点筛查

目的通过基因组扫描和家系连锁分析，对已知病理性近视相关位点进行筛查。方法收集符合常染色体显性遗传的病理性近视家系，选取330对微卫星标记进行基因组扫描，在显性遗传模式、基因频率0．0133和外显率100％的条件下，进行二点连锁分析和多点连锁分析。结果连锁分析在9个家系中均未发现连锁位点。第12号染色体上LODs最大0．773459，最小-8．121303，第18号染色体上LODs最大0．559933，最小-8．936928，排除了与已知病理性近视基因位点MYP2和MYP3连锁。结论我国病理性近视基因位点与国外报道不同，存在遗传异质性。病理性沂视溃传模式可能不旱单一的单蕞冈常染仁．体显件诸俜。     

β-连环蛋白反义cDNA对肝癌细胞恶性表型的影响

目的：探讨应用反义核酸技术降低细胞内β—连环蛋白水平对人肝癌SMMC-7721细胞恶性表型的影响。方法：构建β—连环蛋白反义cDNA重组质粒，转染人肝癌SMMC—7721细胞，筛选β—连环蛋白低表达株，研究其恶性细胞表型的变化。结果：转染β—连环蛋白反义质粒后，低表达β—连环蛋白的SMMC—7721中c-myc基因表达降低，细胞形态向未转化方向变化，细胞生长受到抑制，软琼脂克隆形成率下降，细胞周期发生改变，G0—G1期增加，S期减少。结论：降低β—连环蛋白表达可显著抑制7721细胞的恶性表型。     

肝癌细胞N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达受阻与内质网应激之间的关系

目的:探讨N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(GnTV)表达受阻与内质网应激之间的关系。方法:应用RNAi技术,构建GnTVsiRNA表达质粒,抑制GnTV的表达,用RTPCR和Westernblot检测内质网应激中的重要分子GRP78(glucoseregulatedprotein,葡萄糖调节蛋白)、XBP1(Xboxbindingprotein1,X盒结合蛋白1)和PERK[RNAdependentproteinserine/threoninekinase(PKR)likekinase,RNA依赖蛋白丝/苏氨酸激酶的类似激酶]的表达变化。结果:GRP78的mRNA和蛋白质表达量升高;XBP1的mRNA发生剪接,蛋白分子量从33×103(33kD)变为54×103;PERK蛋白发生磷酸化。结论:GnTV受阻可导致内质网应激。     

过表达α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ通过增强p38MAPK信号通路抑制UVC照射诱导的人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡

 目的 初步探讨α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ（简称FUT7）在UVC照射诱导的人肝癌SMMC-7721(简称7721)细胞凋亡过程中的作用及机制。方法 用RT-PCR检测转染pcDNA3-FUT7质粒的7721细胞及转染空质粒pcDNA3的7721细胞中FUT7基因的转录水平；用流式细胞仪检测细胞表面FUT7产物SLex的表达水平；利用DAPI染核计算UVC照射后细胞的凋亡比率；用结晶紫染色法测定细胞的存活率；利用Western blot检测Caspase3的剪切情况及p38MAPK、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平。结果 过表达FUT7能抑制UVC照射诱导的7721细胞凋亡，同时还增强了细胞中p38MAPK信号通路的活性，而用p38MAPK的特异性抑制剂处理则可削弱FUT7的抗凋亡作用。结论 在UVC照射诱导的7721细胞凋亡过程中FUT7具有抗凋亡的作用，这种作用可能部分通过增强p38MAPK信号通路活性而实现。     

PKB的PH结构域在原核表达及其纯化和活性

目的　利用原核系统表达原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶B(PKB)的PH结构域 ,为进一步研究其结构和功能奠定基础。方法　我们构建了PKB的PH结构域的表达质粒 ,在大肠杆菌中表达出PH结构域 ,并利用蛋白N端加入的组氨酸标签进行亲和层析及离子交换层析纯化蛋白。结果　在大肠杆菌中表达的PH结构域以包涵体形式存在 ,经变性和复性后成为具有天然构象的可溶性蛋白 ,经亲和层析和离子交换层析纯化的PH结构域具有与磷脂酰肌醇PI 4 ,5 P2 的结合能力 ,证明其具有生物学活性。结论　本方法成功表达纯化了PKB的PH结构域 ,可用作PH结构域结构和功能的进一步研究。     

抑制肝癌细胞N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ表达导致细胞未折叠蛋白质反应

目的 探讨N-乙酰氦基葡萄糖转移酶Ⅴ（GnT—Ⅴ）对细胞基因表达和功能的影响。方法 用Western Blot验证GnT-Ⅴ的反义cDNA稳转的细胞株AsGnT—Ⅴ 7721（AsGnT-Ⅴ SMMC 7721）中GnT-Ⅴ表达,用基因芯片技术比较AsGnT—Ⅴ 7721与7721（SMMC-7721）细胞的基因表达差异,同时用RT-PCR和Western Blot检测AsGnT-Ⅴ 7721细胞中未折叠蛋白质反应信号通路关键分子Bip和XBP1的表达变化。结果 基因芯片检测到的AsGnT—Ⅴ 7721细胞中的基因表达变化表明,细胞中产生未折叠蛋白质反应。同时AsGnT-Ⅴ 7721细胞中未折叠蛋白质反应信号途径中的关键分子Bip的mRNA和蛋白表达升高,XBP1 mRNA被剪接。结论 GnT-Ⅴ表达受阻能导致细胞产生未折叠蛋白质反应。     

足细胞中巢蛋白的表达及其相互作用分子的研究

目的 观察细胞骨架蛋白巢蛋白(Nestin)在肾脏足细胞的表达及其在足细胞中的作用方式。方法 免疫组化、免疫荧光、免疫电镜方法检测Nestin在人正常肾组织、体外培养的小鼠足细胞中的表达。免疫共沉淀方法检测足细胞中与巢蛋白相互作用的蛋白分子。结果 在正常肾组织中巢蛋白的表达局限于肾小球。免疫电镜证实巢蛋白主要表达于足细胞胞浆及初级足突，体外培养的足细胞中也可观察到巢蛋白丝状分布于胞浆。免疫共沉淀显示足细胞中Nestin与另两种细胞骨架蛋白波形蛋白(vimentin)、α-internexin相互作用。 结论 巢蛋白除了表达于中枢神经干细胞、胰岛干细胞等之外，在肾脏足细胞中也有表达，并与足细胞中其他细胞骨架蛋白相互作用，共同维持其正常形态和功能。