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目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P＜0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P ＜0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据. 相似文献
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