铜绿假单胞菌Quorum-Sensing系统中rhlR基因的克隆表达及其免疫保护性研究

目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

藏药紫金标抗HSV-1的作用机理研究

目的 :探讨紫金标抗单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV-1)的作用及机理 ,为进一步开发该药提供理论依据。方法 :采用不同剂量的紫金标作用于适量HSV-1感染的Vero细胞 ,以 50%组织细胞感染量 (TCID₅₀ ) ,细胞病变效应(CPE) ,MTT法和核酸分子杂交作为评价指标。结果 :MTT法测得紫金标的 50 %抑制浓度 (IC₅₀ )为 29.46mg·L^-1,50%中毒浓度 (TC₅₀ )为 1 077mg·L^-1,治疗指数 (TI)为 36.56 ,结果表明紫金标有明显抑制HSV-1的作用 ,其作用强度和有效时间与药物浓度成正比。紫金标无直接灭活HSV-1的作用 ,也不能影响病毒的释放 ;但可干扰HSV -1对宿主细胞的吸附。不同浓度的紫金标能明显抑制HSV-1gD基因复制和mRNA表达。结论 :紫金标具有显著的抗HSV-1的作用 ,能抑制HSV-1对宿主细胞的吸附以及抑制HSV-1gD基因复制与转录。     

荆芥挥发油及其主要成分抗流感病毒作用研究

目的:观察荆芥挥发油及其主要成分薄荷酮、胡薄荷酮在鸡胚内及小鼠体内的抗流感病毒作用。方法:分别以预防(鸡胚感染病毒前1h给药)和治疗(鸡胚染毒后1h给药)两种给药方式,经鸡胚尿囊腔和卵黄囊两种给药途径将不同浓度的药物注入鸡胚,孵育48h后收取鸡胚尿囊液进行血凝试验来评价药物在鸡胚内的抗病毒效应。分别以预防(小鼠感染病毒前5d开始给药,连续5d)和治疗(小鼠感染病毒后当天开始给药,连续5d)方式给药,计算肺指数来评价药物的体内抗病毒效应。结果:胡薄荷酮0.1×2-8ml/胚剂量经尿囊腔预防给药后鸡胚尿囊液的血凝滴度明显降低;荆芥挥发油0.05×2-15ml/胚剂量经尿囊腔治疗给药后尿囊液血凝滴度明显降低;荆芥挥发油0.1×2-12、0.05×2-12、0.025×2-12ml/胚剂量与胡薄荷酮0.1×2-8、0.05×2-8、0.025×2-8ml/胚剂量经卵黄囊预防给药后尿囊液血凝滴度明显降低;荆芥挥发油0.1×2-12、0.05×2-12ml/胚、薄荷酮0.05×2-6ml/胚剂量及胡薄荷酮0.1×2-8、0.05×2-8、0.025×2-8ml/胚剂量经卵黄囊治疗给药后尿囊液血凝滴度明显降低。荆芥挥发油0.226ml/kg、薄荷酮0.5ml/kg、胡薄荷酮0.19 ml/kg剂量治疗方式给药明显降低病毒感染小鼠的肺指数。结论:荆芥挥发油及其主要成分胡薄荷酮在鸡胚内具有较好的抗流感病毒作用,且以卵黄囊途径给药效果为优,薄荷酮的抗病毒效应不明显。荆芥挥发油、薄荷酮及胡薄荷酮治疗方式给药对流感病毒感染小鼠有良好保护作用,但预防给药效果不明显。     

可生物降解材料作为基因载体的研究

研究可生物降解聚合物作为控制释放的基因载体。合成聚乳酸-聚乙二醇二元共聚物（Poly（Dl-lactic acid）-co—poly（ethylene glycol，PELA）及聚乳酸-聚乙二醇-聚乙醇酸三元无规共聚物（Poly（lactic acid）-co—poly（ethylene glycol）-co—poly（glycolic acid）random copolymer，PLGAE），包裹质粒pCH110。探讨了PELA和PLGAE作为基因载体包裹DNA的各种影响因素，这两种控制释放体系的体外降解及释放行为以及对它们的细胞毒性及体外转染效率进行了测定。制备的PELA微球平均粒径1～3μm，包裹效率为62％。PLGAE微球平均粒径0．72μm，包裹效率为70％。采用包裹了质粒pCH110的微球对COS-1细胞的细胞毒性及转染实验中得出：二者的细胞毒性较小，PELA和PLGAE的转染效率均较高，且能持续表达96h，其中PLGAE的缓释效果更明显。可生物降解聚合物材料作为基因载体具有较强的优越性。     

Biodegradable Microspheres as Hepatitis B Vaccine Delivery Systems

Hepatitis is a very serious disease that influences humanhealth. Now, nearly 1/3 of the world population has beeninfected with hepatitis B virus (HBV). Among them, 3.5hundred million become the chronic carriers, and 1/4 ofthe carriers would die from the chronic infection of HBV.In China, approximately 7% 20% of the population hasbeen shown to carry HBsAg[1].Development of safe, effective and cheap vaccineswould be a main approach to control the HBV infection.The conventional recomb…     

桂枝挥发油与桂皮醛抗流感病毒作用的实验研究

目的观察桂枝挥发油与桂皮醛在鸡胚内的抗流感病毒作用。方法依据药物对鸡胚的最大无毒浓度设置高、中、低三个剂量组,分别以预防和治疗方式给药,经鸡胚尿囊腔和卵黄囊两种给药途径将药物注入鸡胚,孵育48 h后收取鸡胚尿囊液进行血凝试验来评价药物在鸡胚内的抗病毒效应。结果桂枝挥发油无论经尿囊腔还是卵黄囊途径预防方式给药均对鸡胚尿囊液的血凝滴度无明显影响,但治疗方式给药有一定降低作用;桂皮醛经尿囊腔预防方式给药对血凝滴度无明显影响,但治疗方式给药、及经卵黄囊途径的治疗与预防方式给药,均能明显降低血凝滴度。结论桂枝挥发油、桂皮醛在鸡胚内具有良好的抗流感病毒作用,以治疗方式给药效果相对为优,桂皮醛可能是其抗病毒效应的主要成分之一。     

高直链玉米淀粉对大鼠肠道发酵影响的研究

目的:研究高直链玉米淀粉(high amylase corn starch,HACS)对大鼠肠道发酵的影响。方法:将30只Wistar成年雌鼠随机分为5组,分别喂不添加(对照)和添加5%、10%、20%、30%HACS的饲料。喂养4w后,解剖取小肠、盲肠及盲肠内容物,测定各组体重、饲料效率及淀粉消化率、小肠内容物、盲肠内容物、盲肠组织重量、表面积及盲肠中短链脂肪酸(SCFA)和pH值等。结果:随着饲料中HACS添加量的增加,淀粉表观消化率显著降低,肠道未消化物重量及粪重显著增加。添加20%和30%HACS组的盲肠中乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸和总SCFA及盲肠组织重量均显著高于对照组,但30%HACS组的丙酸、丁酸和总SCFA均低于20%HACS组。添加HACS各组盲肠的pH值均低于对照组,其中20%和30%HACS组达显著水平(P<0.05)。结论:饲料中添加HACS能明显提高盲肠中SCFA的产量,且有明显的剂量关系。     

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜的表达

目的 研究携带Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态Ⅰ类整合酶基因(intI1) mRNA的表达水平,探讨生物被膜中整合子相关的基因转移的分子机制.方法 采用竞争RT-PCR方法定量检测intI1在两株临床分离的铜绿假单胞菌(PA10和PA39)生物被膜菌和浮游菌中mRNA的表达水平.首先用PCR方法从Ⅰ类整合子阳性铜绿假单胞菌全基因组DNA中扩增竞争体DNA (cDNA),再以cDNA为模板体外转录合成竞争体RNA (cRNA);再将不同稀释度的cRNA分别与铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜菌的总RNA提取物进行竞争RT-PCR,产物经电泳分析,以已知cRNA的量确定待测样本中intI1 mRNA的表达量.结果 两株铜绿假单胞菌在其浮游状态和生物被膜状态都有intI1 mRNA表达;两菌的浮游菌和生物被膜菌intI1 mRNA表达量分别近似相等;但两菌生物被膜菌intI1 mRNA的表达量都较其浮游菌高(约15倍).结论 铜绿假单胞菌在生物被膜状态下Ⅰ类整合子intI1 mRNA的表达上调是耐药性广泛传递和多重耐药性形成的可能原因之一.     

中药复方方证相关研究的思路与方法刍议

辨证论治和复方优势是中医的特色和生命力所在。中药复方现代化是中医药现代化的关键内容之一，也是研究的难点和瓶颈之一，尤其是“复方”与“证候”之间的内在关系。方证相关集中体现了中医理论精髓、治疗思路和用药特色。如何用现代科学的语言揭示方证之间的内在联系是中药复方现代化研究的一个关键内容。笔者根据自己的研究结果和思考，结合现代科学，尤其是一些交叉科学的新进展以及当代医学专家的论述，提出了中药复方方证相关研究的思路的初步设想．旨在抛砖引玉。