铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的分析

目的分离鉴定铜绿假单胞菌噬菌体,并对其生物学特性进行研究。方法从居民生活用水下水道中分离出铜绿假单胞菌噬体,利用噬斑测定法纯化所分离的噬菌体,通过负染法电镜观察噬菌体形态及大小。观察并测定噬菌体一步生产曲线,提取噬菌体核酸并进行酶切电泳。结果利用21株铜绿假单胞菌为宿主菌,从下水道中分离出3株铜绿假单胞菌噬菌体,分别命名为PaP-c01、Pap-c02和Pap-c03。噬菌体Pap-c01能裂解6株铜绿假单胞菌,显示出较宽的噬菌谱,酶切电泳显示其基因组大小为32kb。生长曲线显示其感染宿主菌的潜伏期为30min,暴发时间为55min,裂解量为100。结论分离出的噬菌体具有较广的噬菌谱,潜伏期短,裂解量较大,为噬菌体作为生物制剂用于抗感染治疗打下了基础。     

RNAi沉默STAT3基因对人前列腺癌PC3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨pSilencer1．0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人前列腺癌细胞PC3裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 采用裸鼠前列腺癌模型模拟siRNA—STAT3基因治疗实验，观察siRNA—STAT3重组质粒的抗瘤疗效，Western blot法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响，HE及Tunel染色方法观察肿瘤组织形态及细胞凋亡情况。结果 肿瘤接种后第49天重组质粒组肿瘤体积为（391±56）mm^3，盐水对照组为（1111±182）mm^3，空质粒对照组为（981±169）mm^3，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）；重组质粒抑制瘤体内STAT3及pTyr-STAT3基因表达率分别为77％及68％，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。HE染色证实重组质粒组出现大片细胞核固缩、破碎等凋亡征象，Tunel染色显示癌组织出现大量细胞凋亡。结论 pSilencer1．0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人前列腺癌细胞PC3裸鼠移植瘤的生长，具有良好的应用前景。     

大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究

目的通过分离鉴定大肠埃希菌噬菌体,研究其生物学特性。方法利用噬菌斑法从环境污水中分离和鉴定大肠埃希菌噬菌体,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;提取噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果通过噬菌斑法分离出9株大肠埃希菌噬菌体。电镜显示,噬菌体头部呈立体对称,有一长尾。琼脂糖凝胶电泳显示,噬菌体基因组大小约30kb。生长曲线表明噬菌体感染宿主菌的潜伏期为23min,爆发时间为39min,裂解量为78。结论9株大肠埃希菌噬菌体中有6株具有较广的噬菌谱,潜伏期短,裂解量明显,为深入研究大肠埃希菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。     

柯萨奇病毒B4双siRNA表达载体的构建及表达

目的：构建以柯萨奇病毒B4的1A和2A基因为靶基因并带有绿色荧光蛋白标志的可表达发夹结构的双链siRNA的表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A。方法：选择柯萨奇病毒B4的1A和2A区基因21 bp为靶序列分别合成65 bp的互补片段并克隆到pSilencer2.1U6 Neo 和pGCsi-U6/Neo/GFP质粒中,经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离、回收DNA片段,及连接酶连接构建双siRNA表达质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A;将构建的载体转染Hela细胞后,荧光显微镜观察荧光的表达。结果：限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A,有正确的特异性片段,DNA测序也证明其具有正确序列;将该重组质粒转染入Hela细胞后,重组质粒构建成功并在真核细胞内表达GFP,表达时间可达15 d以上。结论：针对柯萨奇病毒B4的1A和2A基因的双siRNA表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A构建成功,并可在真核细胞内持续表达15 d以上。     

RNA干扰技术沉默STAT3对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人前列腺癌细胞PC3及LNCaP的生长抑制作用。　方法: 针对STAT3mRNA序列设计合成 3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,转染PC3及LNCaP细胞;采用Western印迹、Northern印迹等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响;用MTT法观察重组质粒对PC3及LNCaP细胞体外生长抑制作用;用流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导细胞凋亡。　结果: 成功构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,并成功转染PC3及LNCaP细胞;Western印迹,Northern印迹结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制STAT3基因表达,抑制率为60% ~75%;MTT及FCM结果证明上述重组质粒可显著抑制PC3及LNCaP细胞的体外生长并诱导PC3细胞凋亡。结论: pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3可抑制STAT3在人前列腺癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。     

NirB启动子调控下鼠沙门氏菌体内诱导型表达载体的构建

目的构建遗传稳定性良好的沙门氏菌体内诱导型表达载体。方法以克隆载体pGB2为基础,将沙门氏菌厌氧启动子PnirB和EGFP基因串联,并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列,构建沙门氏菌低拷贝体内诱导型表达载体pGnirB-EGFP-rrnb,电转化入鼠伤寒沙门氏菌phoP/phoQ株,对质粒的稳定性及蛋白表达情况进行检测。结果含有低拷贝重组质粒的沙门氏菌在缺失抗生素选择压力下盲传100代后质粒稳定性高于95%,在厌氧静置72 h培养后激光共聚焦显微镜下可观察到明显绿色荧光。结论高度稳定的沙门氏菌体内诱导型表达载体构建成功,为研制以鼠伤寒沙门氏菌为活载体的新型口服疫苗奠定了基础。     

聚肌胞对丝裂霉素C所诱发小鼠骨髓细胞染色体畸变的抑制作用

在ip丝裂霉素C(MMC,5.20 mg·kg~(-1))前24h内将聚肌胞(polv I:C)sc给小鼠,可明显抑制MMC所诱发的小鼠骨髓细胞染色体畸变频率,具有剂量效应关系,Poly I:C(0.50 mg·kg~(-1))sc后4和12h对染色体畸变的抑制作用最强,而polvI:C(0.50 mg·kg~(-1))sc后4 h所取小鼠血清亦具有抑制染色体畸变的作用,结果提示polvI:C和其诱导的小鼠血清均可预防MMC对遗传物质的损伤作用。     

利用siRNA技术沉默膀胱肿瘤STAT3基因及促进凋亡的机制探讨

目的沉默人膀胱移行细胞癌细胞T24的STAT3基因，并探讨其对T24细胞生长抑制及诱导凋亡的作用机制。方法利用含有STAT3 mRNA的siRNA的pSilencer 3．1-siRNA-STAT3重组质粒转染T24细胞；采用Western印迹、RT-PCR等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响；用WTT法观察重组质粒对T24细胞的体外生长抑制作用；用流式细胞术（FCM）及吖啶橙染色检测重组质粒的诱导凋亡作用。结果重组质粒成功转染T24细胞；Western印迹、RT-PCR证实重组质粒在蛋白及mRNA水平都显著抑制STAT3基因的表达水平，抑制率为59％～72％；MTT及FCM证实重组质粒可显著抑制T24细胞的体外生长并诱导细胞凋亡，抑制率及凋亡率分别为53％和17．3％。结论pSilencer 3．1-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3在人膀胱肿瘤细胞的表达，抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。     

共表达野生型p53及siRNA-mdm2质粒的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建可同时表达野生型p53 (wt-p53)及siRNA-mdm2的重组真核表达载体用于激素非依赖性前列腺癌的联合基因治疗。方法：利用亚克隆、T-A克隆和PCR技术合成并构建pcDNA3.1-p53、siRNA-mdm2、p53/siRNA-mdm2和siRNA-scramble重组质粒。脂质体法将上述重组质粒转染至PC-3细胞,半定量RT-PCR和Western blotting检测共表达质粒对mdm2和p53表达的影响,MTT法检测共表达质粒转染后PC-3细胞增殖活性。结果：克隆出wt-p53全长及带有U6启动子的siRNA-mdm2序列,经DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建上述真核重组表达载体;转染细胞48 h后可见siRNA-mdm2组GFP明显表达; RT-PCR和Western blotting检测显示转染共表达质粒后PC-3细胞中 wt-p53表达增强,mdm2表达下调;MTT检测显示共表达质粒转染后PC-3细胞生长抑制率为40.4%。结论：成功构建p53与siRNA-mdm2共表达质粒,共表达质粒可抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖。