急性脑卒中后排尿障碍的相关因素分析

目的观察急性脑卒中患者排尿障碍的表现、特点、转归和相关危险因素。方法选取急性脑卒中伴排尿障碍患者1 561人,统计学单因素分析不同时期的临床表现、特点、转归和相关危险因素。结果与正常组比较,高龄及患有前列腺疾病和泌尿系感染的脑卒中患者更易发生排尿障碍(P<0.05);脑卒中后排尿障碍与性别及脑卒中危险因素(高血压、糖尿病、心脏病、吸烟、饮酒)无关(P>0.05);脑卒中患者发病部位和类型与排尿障碍类型有相关性。结论脑卒中患者的发病部位、类型及患者的年龄、是否患有前列腺疾病、是否患有泌尿系感染是排尿困难发生的危险因素,应根据患者的具体情况谨慎对待。     

表达大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)腺相关病毒的构建及体外表达分析

目的构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并检测体外表达目的基因的能力。方法应用基因克隆技术将大鼠BDNF的cDNA基因序列克隆入腺病毒质粒pAAV-MCS,PCR酶切测序鉴定序列。与AAV病毒包装质粒pAAV-RC、pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到含转基因过表达BDNF的病毒载体(rAAV-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况,用ELISA法测定培养液中表达产物浓度。结果证实BDNFcDNA片段插入到病毒基因组内,并整合到宿主基因组后稳定表达,病毒滴度可以达到1.29×108PFU/mL。重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF,ELISA结果表明,Hela细胞从病毒感染后第2天到第10天表达BDNF水平呈上升趋势,第10天达到2253pg/mL。结论成功地构建了表达BDNF基因的腺相关病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究奠定了方法学基础。     

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的 检测真核表达克隆pcDNA3.1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)的水平和有效性.方法 采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段,构建到T载体中,并转接到pcDNA3.1中;同时设计引物进行全基因测序;采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因,通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3.1-NMNAT1的表达水平和表达有效性,并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法.结果 成功钓取了小鼠源NMNAT1基因,测序结果显示与数据库序列完全匹配,pcDNA3.1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系,48 h以后收取细胞,经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测,结果显示表达克隆pCDNA3.1-NMNAT1能同时在mRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因.结论 成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA,与Pubmed序列完全一致,并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质.     

17-β雌二醇对大鼠海马神经元保护作用的实验研究

目的研究17-β雌二醇对大鼠海马神经元树突生长的影响及血清饥饿情况下对神经元存活率的影响。方法体外培养3d的海马神经元通过加入浓度为1nmol/L和2nmol/L的17-雌二醇,统计比较神经元树突的数目和长度;体外培养1d的海马神经元,加入17-雌二醇,培养6～7d后血清饥饿48h后进行NSE染色及MTT检测,检测神经元形态及神经元存活率。结果 17-雌二醇可显著增加存活神经元树突的长度和数量;并能够有效地抑制血清饥饿引起的细胞减少,增加其存活率。结论 17-β雌二醇对大鼠海马神经元的生长发育及存活具有保护性作用。     

大鼠海马CA1脑区慢病毒载体注射方法学改进

目的：采用电极埋管的改进方式进行大鼠海马CA1脑区慢病毒载体注射的方法，并检测此方法的有效性和安全性。方法：45只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(SH)、生理盐水组(NS)和eGFP慢病毒注射组(eGFP)，每组15只。所有实验大鼠在脑立体定位仪下定位海马CA1组织，采用电极埋管的改进方式进行慢病毒注射。NS组给予生理盐水(2 μL)、eGFP组给予慢病毒(2 μL)，SH组只实行手术操作。注射病毒7、14和30 d后，分别处死大鼠并进行全脑冰冻切片，荧光显微镜观察eGFP慢病毒注射组的GFP绿色荧光表达水平和脑区分布。同时取相邻冰冻切片进行Nissl染色，检测eGFP慢病毒注射组的海马CA1脑区的损伤程度。结果：eGFP慢病毒注射成年大鼠海马CA1脑区7、14和30 d后，均可以成功检测到GFP在海马CA1脑区的表达，且表达水平和脑区分布均保持稳定，不随注射后切片时间的变化而变化。Nissl染色结果显示,神经元存活数目在eGFP慢病毒注射组与假手术组、生理盐水组比较均无显著性差异（P>0.05）。结论：成功建立了电极埋管的方式向大鼠海马脑区注射慢病毒的方法，并可在海马CA1脑区高水平表达其所携带的目的基因，为进一步的在成年大鼠海马CA1脑区进行基因操作奠定了基础。     

表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元保护作用的研究

目的：研究表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒（rAAV-BDNF）对体外培养海马神经元的保护机制。方法：通过去血清培养诱导神经元凋亡后转染rAAV-BDNF,通过DAPI、PI及Actin染色来统计rAAV-BDNF对血清饥饿引起的细胞凋亡的数量及形态的影响。结果：rAAV-BDNF病毒能够有效地抑制血清饥饿引起的细胞凋亡,其保护效率在65左右,并可以有效地保护血清饥饿引起的细胞形态损伤。结论：rAAV-BDNF可通过抑制凋亡的途径保护体外培养的海马神经元。     

人参皂苷Rb1对Aβ淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的：研究人参皂苷Rb1对Aβ淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元损伤的影响,为其临床应用提供理论依据。方法：体外原代培养的SD大鼠海马神经元经Aβ淀粉样蛋白损伤建立细胞模型,实验分为正常对照组、Aβ淀粉样蛋白诱导损伤对照组(损伤对照组)、Rb1低剂量组（10 mg/L）、Rb1中剂量组（50 mg/L）及Rb1高剂量组（100 mg/L）,应用MTT法检测海马神经元生长增殖活力,TUNEL法检测神经元凋亡情况,化学发光法检测海马神经元内caspase-3活性。结果：MTT法检测结果显示,与正常对照组比较,损伤对照组和Rb1低、中及高剂量组神经元生存率均有不同程度的下降(P<0.05),损伤对照组下降最明显;与损伤对照组比较,Rb1中、高剂量组神经元生存率明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。TUNEL法检测结果显示,与正常对照组比较,损伤对照组、Rb1低、中剂量组的阳性神经元数量明显增加,其中损伤对照组增加最明显;损伤对照组与Rb1高剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。损伤对照组caspase-3活性与Rb1高剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：人参皂苷Rb1对Aβ淀粉样蛋白诱导性神经元损伤具有保护作用,并通过调控细胞凋亡实现。     

白细胞介素12和18在P0 180-199特异性T细胞致神经炎中的协同增强效应

目的：观察白细胞介素12和18是否在P0 180-199特异性T细胞过继的实验性自身免疫性神经炎中发挥协同增强作用。方法：实验于2003-03／2004-08在哈尔滨医科大学神经病理实验室完成。选取14-16周龄健康纯系雌性Lewis鼠50只。随机均分为5组，阴性对照组，自细胞介素12组，白细胞介素18组，白细胞介素12和18联合组，P0阳性对照组，每组10只。用白细胞介素12租钱18体外预孵育的P0 180-199特异性T细胞过继动物，引发过继性实验性自身免疫性神经炎后，观察和评估单独组和联合组的临床症状和病理改变。由2个观察者采取双盲法，每日对每只鼠进行临床评分，分值为两个得分的平均数。结果：50只小鼠在实验过程中无死亡，全部进入结果分析。①20mg/L的P0 180-199具有最强的T细胞增殖能力，可选择这个浓度体外扩增Po 180-199T细胞系。②P0对照组的过继性实验性自身免疫性神经炎发病率低（2／10），白细胞介素12和18联合组的所有大鼠均有发病（10／10）。白细胞介素12和18联合组的病情严重，甚至有1只大鼠死于呼吸麻痹，发病时间和发病高峰时间均显著低于白细胞介素12组以及白细胞介素18组[（2．6&;#177;0．8）．（3．2&;#177;0．9）．（3．4&;#177;0．9）d，t=2．7，P〈0．05]，[（5．8&;#177;1．4），（6．6&;#177;1．9），（8．1&;#177;1．8）d，t=2．7，P〈0．05]。⑨白细胞介素12和18联合组病理表现为坐骨神经内的炎细胞的浸润数目增加和脱髓鞘的面积增加显著高于单独致敏的白细胞介素12组或白细胞介素18组，差异均有显著性意义[（37．1&;#177;11．2）．（19．1&;#177;6．1），（14．6&;#177;4．9）个/mm^2，t=3．6，P〈0．051；[（3．2&;#177;0．6），（2．3&;#177;0.3），（2．0&;#177;0.3），t=3．1，P〈0．05]。结论：白细胞介素12和18联合孵育的Po 180-199特异性T细胞具有更强的致神经炎作用，临床表现为更高的发病率，更严重的神经炎和更延迟的恢复期。     

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定.方法:针对筛选确定的人STUB1 基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I 和EcoR I 酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA 慢病毒载体.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒.结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒.结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体.     

腺相关病毒介导的脑源性神经营养因子基因对大鼠海马神经元树突生长的影响

目的研究重组腺相关病毒介导的脑源性神经营养因子基因（rAAV-BDNF）的表达对体外培养的大鼠海马神经元树突生长的影响。方法取孕18d大鼠建立体外培养的海马神经元模型,感染rAAV-BDNF病毒。在检测了BDNF稳定的表达水平后,用MAP2染色法来标示神经元树突形态。用荧光显微镜采样,统计胞体约15～20μm的MAP2阳性细胞初级树突的数目和长度。对照组神经元为感染表达绿色荧光蛋白的腺相关病毒。结果感染rAAV-BDNF的海马神经元初级树突数目为（14±3）个,对照组的初级树突数目为（6±1）个。rAAV-BDNF感染的海马神经元树突总长度为（1500±150）μm,对照组的树突总长度为（700±50）μm,两组无论是树突数目还是长度,差异均有统计学意义（t=3.088和6.238,均P〈0.05）。结论rAAV-BDNF转染大鼠体外培养的海马神经元后,能起到促进树突生长的作用。