BMP9诱导可逆永生化小鼠瓣膜间质细胞成骨能力研究

目的：建立具有快速增殖能力的可逆永生化主动脉瓣膜间质细胞系。方法：体视显微镜下利用弹簧剪夹取瓣膜组织,胶原酶消化后加入逆转录永生化病毒,利用免疫荧光鉴定细胞是否属于间质细胞,显微镜观察细胞形态,结晶紫、CCK-8和流式细胞周期技术检测细胞增殖能力,碱性磷酸酶染色和茜素红钙盐沉积实验检测细胞成骨能力,q-PCR及Western blot检测细胞成骨标志物。结果：经光镜观察和免疫荧光鉴定,成功取到瓣膜间质细胞。加入永生化病毒后,经光镜观察和免疫荧光确认瓣膜间质细胞未发生表型改变,且在永生化的细胞中能够检测到大量SV40T(P<0.001)。结晶紫染色、CCK-8(P<0.001)和流式细胞周期结果提示永生化后的瓣膜间质细胞增殖速度变快。加入成骨诱导因子骨形态发生蛋白-9(bone morphogenetic protein9,BMP9)后永生化瓣膜间质细胞表现出较好的成骨能力,多数成骨标志物在分子层面的RNA和蛋白水平明显升高。去永生化后瓣膜间质细胞形态无明显改变,q-PCR结果显示SV40T明显降低（P<0.001）,细胞增殖能力明显下降,且细胞周期被阻滞在G0/G1期...     

人参皂苷Rh2抑制肝癌HepG2细胞迁移的实验研究

目的:研究人参皂苷Rh2对肝癌Hep G2细胞迁移的影响及其机制。方法:取对数生长期Hep G2细胞,Rh2(10~160μmol/L)诱导,同时设空白对照组,用CCK-8检测Rh2对细胞增殖影响;Transwell检测Rh2对细胞的迁移的影响;荧光素报告基因筛选可能的信号通路;Western blot检测Hep G2细胞中P-ERK、ERK、P-P38、P-38、P-JUK、JUK、MMP3等蛋白的表达;定量PCR方法检测AP1、MMP3基因的表达;荧光显微镜分别观察AP1、MMP3蛋白在细胞内的表达及分布。结果:CCK-8检测结果显示Rh2对肝癌Hep G2细胞生长抑制呈剂量和时间依赖性;Transwell检测显示Rh2对肝癌Hep G2细胞迁移有明显的抑制作用;荧光素报告基因筛选出AP1转录因子;Western blot检测结果显示P-ERK、MMP3蛋白表达水平呈下降趋势,PJUK、P-P38蛋白表达水平明显升高,ERK、JUK、P38蛋白则无明显变化;定量PCR方法结果显示:AP1、MMP3的基因表达下降。荧光结果显示:AP1、MMP3均分布在胞质内,随药物浓度的增加其荧光表达量减弱。结论:人参皂苷Rh2可通过激活MAPK通路来抑制肝癌Hep G2细胞的迁移。     

稳定表达HBx的HepG2细胞对罗格列酮敏感性的影响及其机制研究

目的：构建稳定表达x基因编码的乙型肝炎病毒x蛋白（x protein of hepatitis B virus，HBx）的HepG2细胞，检测其对罗格列酮敏感性的变化，并探讨HBx与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）之间的相互作用在原发性肝癌形成过程中的可能机制。方法：构建plRES2-HBx真核表达质粒，筛选稳定表达HBx的HepG2细胞；MTT法检测细胞对罗格列酮的敏感性；免疫细胞化学法检测PPARγ定位的变化；RT—PCR和Western印迹法检测PPART的表达。结果：成功构建pIRES2-HBx真核表达质粒，获得稳定表达HBx的HepG2细胞；罗格列酮对该细胞的抑制作用明显降低（P〈0．05），经丝裂原活化蛋白激酶／细胞外信号调节激酶的激酶1（mitogen-activated protein kinase／extra-cellular signalregulated kinase kinase 1，MEK1）抑制剂PD98059预处理后，抑制率有所回升；PPARγ表达量变化的差异无统计学意义，但在细胞中的表达位置发生改变，即从细胞核转至细胞质。结论：HBx可降低HepG2细胞对罗格列酮的敏感性，可能的机制是HBx可改变PPARγ在细胞内的定位以及与DNA的结合能力．并通过磷酸化狳径影响PPARγ与配体的结合能力及其活性。     

人骨形态发生蛋白3抑制骨肉瘤细胞系MG63和U20S的体外生长

目的 研究人骨形态发生蛋白3（hBMP3）对骨肉瘤细胞系MG63和U2OS的生物学作用。方法 hBMP3的重组腺病毒和表达hBMP3的条件培养液（rhBMP3-CM）干预MG63和U2OS,台盼蓝拒染法、TUNEL法、吖啶橙/溴乙啶荧光双染法、Transwell小室和碱性磷酸酶活性测定法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移以及成骨分化能力的变化;空白组不做任何处理,实验对照组用AdGFP组和rGFP-CM处理。 结果 实验对照组和空白组间差别无显著性。与各自的对照组相比,在观察时间内,两种处理均致实验组细胞：（1）存活率降低;（2）凋亡率增加;（3）穿膜细胞数减少;（4）碱性磷酸酶活性增加。 结论 hBMP3对骨肉瘤细胞系具有抑制作用,并促其向成骨方向分化。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

人参皂苷单体Rb1及Rg1对白血病细胞K562增殖的影响

背景：国内外研究发现人参皂苷及其单体在抑制白血病细胞增殖、增加化疗药物的敏感性和逆转耐药等方面均有疗效，目前主要集中于对实体瘤和急性白血病的研究，涉及慢性白血病的报道非常少。 目的：探讨人参皂苷单体Rb1，Rg1对人慢性粒细胞白血病细胞K562增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03/2009-03在重庆医科大学干细胞与组织工程研究室和眼科实验室完成。 材料：K562细胞由重庆医科大学临床检验系提供。纯度为98.6%的人参皂苷单体Rb1，Rg1由南京艾斯替么中药研究所提供。 方法：取对数生长期的K562细胞，调整密度为7×108 L-1，空白对照组予以常规培养；人参皂苷单体Rb1组分别加入20，40，80，160 μmol/L的Rb1；人参皂苷单体Rg1组分别加入5，10，20，40，80 μmol/L的Rg1。 主要观察指标：MTT比色法、锥虫蓝拒染法检测K562细胞增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。 结果：人参皂苷单体Rb1，Rg1在体外对K562细胞增殖均有明显的抑制作用，在20~160 μmol/L Rb1和5~20 μmol/L Rg1浓度范围内，其抑制作用呈浓度依赖性，且均在作用48 h时抑制率达高峰。与空白对照组比较，体外培养48 h后160 μmol/L Rb1组细胞周期分布无变化；20 μmol/L Rg1组S期细胞比例明显增加(P < 0.05)，G1期细胞比例明显下降(P < 0.05)，且160 μmol/L Rb1组、20 μmol/L Rg1组均未出现“亚二倍体”峰。 结论：人参皂苷单体Rb1，Rg1均可抑制K562细胞增殖，Rg1增殖抑制作用可能是通过将K562细胞阻滞于S期而实现的，而Rb1的增殖抑制作用与细胞周期的关系有待进一步分析。     

《临床检验基础》多维教学模式的构建

建构主义理论的核心是“以学生为中心,强调学生对知识的主动探索、主动发现和对所学知识意义的主动建构”。以此理论为指导,在《临床检验基础》课程中构建基于课堂教学、网络平台和创新实验的三维立体教学模式,使学生在教学活动中不再是被动接受者,而是积极主动的参与者。实践表明,这种模式培养了学生的学习兴趣,同时也提高了学生的自主学习和创新能力以及综合素质。     

人S100A2-GST融合蛋白原核表达和纯化

目的：制备人S100A2-GST融合蛋白（HumanS100A2-GST fusion protein,hSIOOA2-GST）,为进一步研究人hS100A2蛋白的功能及其与其它因子或系统的相互作用奠定基咄。方法：从pHAHA-hS100A2中双酶切获取hS100A2基因,亚克隆至原恢≠若盘载体pGST-molue,构建pGST-molue-hS100A2,转化BL21后酶切鉴定,IPTG诱导重组菌表达融合蛋白hS100A2-GST,再经过Glutathion-Sepharose4B球珠分离纯化、SDS-PAGE及Western Blot鉴定,Bradford法蛋白定量。结果：XhoI和EcoRI双酶切该重组质粒后获得2个片段,分别约300bp和5kh,提示pGST-moluc-hS100A2构建正确;重组菌株经过IPTG诱导后,表达分子量约为36kD的蛋白,产率达5mg／L菌液;Glutathion～Sepharose4B球珠纯化后,该融和蛋白纯度达92％;WesternBlot显示该蛋白可以被S100A2的抗体特异识别,证实其为hS100A2-GST融合蛋白。结论：成功构建了hS100A2-GST原核表达质粒pGST-moluc-hS100A2;该质粒可在大肠杆菌中诱导表达hS100A2-GST融合蛋白,产率高;应用Glutathion-Sepharose4B球珠可获得纯度达92％的该蛋白。为后续有关hS100A2的研究打下了基础。     

比较两种方法对牛鲍氏计数板中细胞计数结果的影响

目的 比较牛鲍氏计数板的传统计数方法和新计数方法对细胞计数结果的影响.方法 用传统计数方法和新计数方法计数118份抗凝血标本中的红细胞,然后将结果与标准值对照.结果 在109份有效样本中,有57份(52.29％)用新方法计数结果更准确,40份(36.70％)用传统方法计数结果更准确,12份(11.01％)用两种方法计数引出的误差相同.新方法计数误差的平均值为(0.071±0.005)×1012/L,明显低于传统方法计数误差的平均值(0.079±0.006)×1012/L,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 采用新方法在减小牛鲍氏计数板对细胞计数的误差方面可能有一定的作用.