IL-10、TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的影响

目的 研究IL-10和TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的分化与功能的影响.方法 健康志愿者和慢性乙型肝炎患者各15例,取外周静脉血,分离获得外周血单个核细胞(PBMC),常规培养获得DC组.培养期间用IL-10刺激的为imDC组;TNF-α刺激的为mDC组;先后用IL-10、TNF-α刺激的为imDC+TNF-α组.各组收获细胞后分别检测反映DC成熟度的各种分子及其体外诱导的自体淋巴细胞增殖效应.结果 源于慢性乙型肝炎患者的常规培养的Dc在数量,HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86表达,IL-12p70分泌及其诱导的淋巴细胞增殖效应,均低于健康者组(P＜0.01).源于慢性乙型肝炎患者的mDC与健康者mDC表达的HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86比较无显著性差异;2组mDC诱导自体淋巴细胞增殖效应和分泌的IL12p70均明显增加,比较有显著性差异(P＜0.01);2组imDC的HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86低表达,分泌的IL-12p70极低,不能强烈激活诱导淋巴细胞增殖效应,与DC组比较有显著性差异(P＜0.01).加入TNF-α刺激后HLA-A、B、C,HLA-DR,CD86仍低表达,分泌的IL-12pT0和淋巴细胞增殖效应仍较低.健康对照组、慢性乙型肝炎组的上清夜中IL-21的ELISA检测值均较低,无显著性差异.结论慢性乙型肝炎患者常规培养的DC在数量和功能上低于健康者.TNF-α可促进常规培养的DC成熟为mDC、IL-10可抑制DC成熟.慢性乙型肝炎患者的DC同健康者一样可进行有效的调控,分化成熟后功能强于健康者常规培养的DC,或可提高自体DC治疗性疫苗在不同免疫状态下的治疗效果.     

HBV无症状携带者树突状细胞的分化及功能研究

目的 研究HBV无症状携带者树突状细胞的分化及功能.方法 抽取健康对照者(A组)、HBV无症状携带者(B组)外周静脉血,经密度梯度离心法分离获得PBMC,用TNF-α、IL-10分别和rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养,获得:成熟树突状细胞(mDC)、不成熟树突状细胞(imDC).rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养获得树突状细胞(DC)作组内对照.imDC组加入TNF-α刺激,检验imDC的稳定性.流式细胞仪检测各组反映树突状细胞成熟度的各种分子.结果 A、B组内mDC细胞膜表达HLA-DR,HLA-ABC分子,分泌的IL-12p70与imDC、DC、imDC+TNF-α组相比明显增加;A、B组间mDC的HLA-DR,HLA-ABC表达无显著性差异,IL-12p70分泌差异有统计学意义(P<0.01).imDC的HLA-ABC、HLA-DR低表达,IL-12p70分泌也较低,与本组内DC比较结果差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间imDC的HLA-DR,HLA-ABC低表达,IL-12p70分泌差异无统计学意义.imDC加入TNF-α后HLA-ABC、HLA-DR仍低表达,IL-12p70分泌低于本组内DC,结果差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间结果无显著性差异.结论 在A、B组,TNF-α均有效促进DC成熟为mDC,IL-10均抑制DC的成熟,不受A、B组细胞来源影响.mDC分泌大量IL-12p70,并在B组低于A组,说明B组mDC存在一定的功能不足.     

抗菌药物分级管理与结果分析

目的了解抗菌药物分级管理干预措施的实施及效果.方法 从医院信息系统抗菌药物分级管理子系统中采集干预前和干预后两组出院患者的抗菌药物使用信息,进行回顾性比较及分析.结果干预后组和干预前组比较,抗菌药物使用率、人均抗菌药物费用、人均抗菌药物使用频次、二线、三线抗菌药物使用比例均显著减少.但各病区执行情况有差异,第三代头孢类抗菌素用量较大.结论实施分级管理有利于抗菌药物的合理使用,管理措施应进一步加强.     

肝癌细胞HepG2间的P-糖蛋白传递作用

目的 探讨肝癌细胞株HepG2细胞间是否存在P-糖蛋白(P-gp)的传递及P-gp与多药耐药基因(mdrl)的关系.方法 将pSUPER.neo+GFP质粒转染至HepG2细胞(命名为HepG2/GFP),并与阿霉素耐药HepG2细胞(命名为HepG2/ADM)混合培养.激光共聚焦显微镜观察肝癌细胞间P-gp的传递.免疫磁珠法分离混合培养细胞,收集原HepG2/GFP细胞(命名为HepG2/aqMDR),采用Western blot分析HepG2、HepG2/ADM、HepG2/GFP,HepG2/aqMDR细胞的P-gP表达水平,同时应用实时荧光定量PCR分析这些细胞mdrl mRNA的表达水平.多样本均数比较用单因素方差分析,进一步两两比较用SNK-q检验. 结果荧光显微镜下可见大量带绿色荧光的稳定克隆.激光共聚焦显微镜下见HepG2/aqMDR细胞以黄色荧光为主,而HepG2/GFP以绿色荧光为主,HepG2/ADM以红色荧光为主.Western blot检测结果显示HepG2/aqMDR细胞中P-gp表达水平低于HepG2/ADM,但明显高于HepG2/GFP(q＝35.07,P<0.05)与HepG2(q=36.87,P<0.05).实时荧光定量PCR结果显示,HepG2/ADM细胞中mdrl mRNA表达水平较高,而HepG2/aqMDR、HepG2、HepG2/GFP三组细胞中mdrl的mRNA表达水平差异没有统计学意义(F＝2.30,P>0.05).结论 P-gP可以从耐药肝癌细胞传递至敏感肝癌细胞,这一现象为进一步研究肝癌多药耐药机制提供了新的思路.     

γδT细胞在疾病中的作用

γδT细胞是皮肤表皮内淋巴细胞和粘膜组织上皮内淋巴细胞的主要成分之一,为非特异性免疫细胞。活化的γδT细胞具有较强的杀伤活性,具有抗感染、抗肿瘤作用;γδT细胞还可以维持免疫耐受,调节免疫应签,异常可导致自身免疫性疾病的发生。因此尽管γδT细胞在人类庞大复杂的免疫体系中数量较少,但却具有不可替代的重要功能。     

脱氧氮杂胞苷诱导HepG2细胞表达主要组织相容性复合体Ⅰ类分子A

Objective Major histocompatibility complex class I Crelated molecules A and B(MICA and MICB) are innate immune system ligands for the NKG2D receptor expressed by natural killer cells and activated CD8(+)T cells.Our previous study showed that 5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-dC),a DNA methyltransferase inhibitor,can induce the expression of MICB and sensitized cells to NKL-cell-mediated cytolysis.The aim of this study was to determine the expression level of MICA in HepG2 cells(an HCC cell line)and L02 cells(a normal liver cell),and to investigate the effect of 5-aza-dC on MICA expression in HepG2 cells.Methods Cells were treated with 5-aza-dC,caffeine and ATM-specific siRNA.The cell surface MICA protein on HepG2 cells and L02 cells was determined using flow cytometry.The mRNA level was detected using realtimeRT-PCR.Result MICA was undetectable on the surface of L02 cells,but was highly expressed on HepG2 cells.MICA expression was upregulated in response to 5-aza-dC treatment(P＜0.05),and the upregulation of MICA was partially prevented by pharmacological or genetic inhibition of ataxia telangiectasia mutated(ATM)kinase(P＜0.05).Conclusion Our data suggest that 5-aza-dC induces the expression of MICA by a DNA damage-dependent mechanism.     

长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和复制

目的 评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应.方法将HBV基因组S区的全部核苷酸序列插入至pTARGETTM载体中,并将重组载体转染入HepG2.2.15细胞中.用酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg水平,用荧光定量PCR法检测HBVDNA水平.对数据采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验与两两比较的Mann-Whitney U检验.结果 经过处理后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg表达量(A值)在HBS2组(携带长片段反义RNA)为0.621±0.027,在HBS4组(携带正义RNA)为3.399±0.018,对照组为2.232±0.187;HBeAg表达量(A值)在HBS2组、HBS4组和对照组分别为0.749±0.019、1.548±0.025和1.570±0.044; HBV DNA水平(×104拷贝/ml)在HBS2组、HBS4组、对照组分别为1.597±0.082、3.381±0.297和3.610±0.063.与对照组相比,HBS2组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达量均降低,统计量Z值均为-2.309,P值均＜0.05; HBS4组HBsAg表达量增高(Z=-2.309,P＜0.05),而HBeAg和HBV DNA表达量无明显差异,统计量Z值分别为-0.866、-1.155,P值均＞0.05.结论 长片段反义RNA能抑制HBV基因的表达和病毒复制.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of long antisense RNA on HBV replication in HepG2.2.15 cells. Methods The coding region of HBV S gene was cloned into pTARGET vector in sense and antisense orientations and the recombinant plasmids were transfected into HepG2.2.15 cells which were divided into HBS2 (antisense RNA) group, HBS4 (sense RNA) group and control group. HBsAg and HBeAg in the culture supernant were detected by ELISA. The HBV DNA in the supernant was quantified by real-time PCR. Results After treatment, the levels of HBsAg in HepG2.2.15 cell supernatants of three groups were 0.621 ± 0.027, 3.399 ± 0.018 and 2.232 ± 0.187 respectively; the levels of HBeAg were 0.749 ± 0.019,1.548 ± 0.025 and 1.570 ± 0.044 respectively and the levels of HBV DNA were 1.597 ± 0.082, 3.381 ± 0.297 and 3.610 ± 0.063 respectively. The expressions of HBsAg and HBeAg and the HBV DNA level in HBS2 group were remarkably reduced as compared to the control (Z = -2.309, P ＜ 0.05); whereas the sense plasmid transfection (HBS4) did not affect HBeAg (Z= -0.866) and HBV DNA (Z = -1.155) levels in the culture supernant but slightly increased the HBsAg level (Z = -2.309). Conclusion Antisense RNA might be a useful tool to repress HBV replication.     

抗菌药物分级管理与结果分析

目的了解抗菌药物分级管理干预措施的实施及效果。方法从医院信息系统抗菌药物分级管理子系统中采集干预前和干预后两组出院患者的抗菌药物使用信息，对其进行回顾性比较及分析。结果干预后组和干预前组比较．抗菌药物使用率、人均抗菌药物费用、人均抗菌药物使用频次、二线（三线）抗菌药物使用比例均显著减少。但各病区执行情况有差异．第三代头孢类抗菌素用量较大。结论实施分级管理有利于抗菌药物的合理使用．但管理措施应进一步加强。     

脱氧氮杂胞苷诱导HepG2细胞表达主要组织相容性复合体Ⅰ类分子A

目的 观察主要组织相容性复合体Ⅰ类分子A(MICA)在HepG2与L02细胞株中表达的差异及脱氧氮杂胞苷(5-aza-dC)对HepG2细胞株MICA表达的影响,探讨毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ATM)依赖的DNA损伤途径与5-aza-dC调节MICA表达的关系. 方法同时接种并培养L02和HepG2细胞,在同一时间点收取细胞,流式细胞仪检测细胞膜MICA蛋白表达水平;不同浓度5-aza-dC(0.1,1.0,5.0mmol/L)作用于HepG2细胞不同时间(24、48、72、96h)后,定量PCR检测MICA mRNA水平以寻找5-aza-dC最佳作用浓度和时间;ATM特异性抑制剂咖啡因或RNA干扰技术干扰ATM表达,定量PCR检测细胞mRNA水平,流式细胞术检测细胞膜MICA蛋白表达水平.结果 数据比较采用Kruskal-Wallis和Mean-Whitney U方差分析.结果 流式细胞结果显示,HepG2细胞高水平表达MICA,而正常肝细胞L02几乎不表达MICA;5-aza-dC处理可上调HepG2细胞MICA的表达(X2=7.20,P＜0.05),这种上调作用可被ATM特异性阻滞剂咖啡因和ATM特异的小分子干扰RNA所阻断(U=0.00,P＜0.05).结论 MICA在正常肝细胞株中无表达,在肝癌细胞株中高表达;5-aza-dC可诱导HepG2细胞MICA的表达,其机制可能与5-aza-dC引起的ATM依赖的DNA损伤途径有关.     

TSA对不同肝癌细胞株增殖和凋亡的作用及其对HBV复制的影响

目的:比较组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)抑制剂HDAC曲古抑菌素A(Trichostain A,TSA)对不同肝癌细胞株和正常肝细胞株增殖和凋亡的作用.初步研究TSA对HBV复制的影响.方法:应用四氮唑蓝(MTT)法,DNA琼脂糖凝胶电泳检测经不同浓度TSA处理过的3种肝癌细胞株HepG2、QGY7701、HepG2.2.15和正常肝细胞株L02,观察细胞增殖和凋亡的改变.用微离子酶联免疫法检测TSA处理组和对照组HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,实时荧光定量PCR检测细胞上清中HBV DNA含量,初步探讨TSA对HBV复制的影响.结果:TSA在一定浓度范围内能明显抑制不同肝癌细胞株的增殖,呈剂量依赖关系.对正常肝细胞株L02的增殖无明显影响.DNA凝胶电泳结果显示:在TSA处理组的3种肝癌细胞株HepG2、QGY7701、HepG2.2.15中可观察到细胞凋亡特异的DNA梯形带,然而,在对照组及正常肝细胞株中未见DNA梯形带.经TSA处理后的HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的含量均高于对照组1倍以上(P＜0.05).结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA虽然可抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡,但是,TSA刺激HBV的复制.因此,对HBV阳性的肝癌患者,应尽量避免使用TSA.