人源化抗体构建过程中假链的产生及应对策略

目的在人源化抗体构建过程中，采用方便、快捷的分子克隆手段。消除SP2／0内源性畸形轻链转录本以获得正确的轻链cDNA。方法在mRNA抽提时，不用常规的TRIZOL法抽提总RNA，而采用经腹腔培养。生长状态良好的杂交瘤细胞。用QIAGEN公司Oligotex Direct mRNA Purification Kit，将polyA^＋的mRNA富集。可有效减少畸变转录本的含量，提高功能型mRNA的丰度。利用polyA^＋RNA。采用RT-PCR，我们成功地克隆到了轻链可变区序列，序列分析证实读码框完全正确，属于轻链可变区基因。结果NCBI数据库BLAST显示。克隆的基因序列符合小鼠lg可变区特征，具有正确的CDR和FR功能区及VJ连接区。结论采用polyA^＋ mRNA富集技术，成功克隆获得阻断型抗人CD154 mAb（4F1）单克隆抗体的轻链、重链可变区基因，成功地消除了SP2／0内源性畸形转录本对免疫球蛋白功能性轻链基因的影响。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及其功能研究

目的:实现抗人CD40的人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)在的CHO细胞中的稳定表达并对其生物学活性进行初步的研究。方法:pIRES/hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,采用RT-PCR对CHO细胞进行基因水平鉴定,以流式细胞术(FCM)和Western blot对表达上清中ch-5C11人免疫球蛋白Fc段和κ链成分进行检测,利用Protein G亲和层析和Lowry法进行纯化和定量,MTT实验检测表达ch-5C11对Daudi细胞增殖的抑制效应。结果:获得稳定分泌目的蛋白的CHO稳定株,RT-PCR结果表明目的基因成功整合在CHO稳定株中,FCM和Western blot结果表明稳定株上清中含有抗人CD40抗体,且含人免疫球蛋白Fc段和κ链;Lowry法定量ch-5C11浓度为0.535mg/L,并经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好;ch-5C11能抑制Daudi细胞增殖。结论:获得了持续分泌ch-5C11的CHO稳定株,功能学研究显示ch-5C11能抑制B细胞淋巴瘤细胞株体外增殖。     

人PD-L1基因转染细胞株的构建及其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株,观察其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响。方法:将编码人PD-L1分子的全长c DNA重组入反转录病毒表达载体p EGZ-Term-R,将重组载体p EGZ-Term-R/PD-L1和辅助病毒载体用脂质体法共转染293T细胞,包装具有感染能力的完整病毒;收集含有完整重组反转录病毒的293T细胞培养上清,感染L929细胞,筛选并获得G418抗性的基因转染细胞。采用流式细胞术检测表达PDL1的基因转染细胞,命名为L929/PD-L1。采用PHA活化T细胞系来源的细胞株Jurkat,并将其与丝裂霉素预处理的L929/PD-L1细胞共培养,用细胞计数法观察L929/PD-L1细胞株对活化的Jurkat细胞增殖能力的影响,并检测其凋亡情况。结果:成功获得了稳定表达人PD-L1基因的转染细胞株L929/PD-L1。PHA可诱导Jurkat细胞活化并表达PD-1分子;L929/PD-L1与PHA刺激后的Jurkat细胞共培养,可抑制Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。结论:成功构建了稳定表达人PD-L1的细胞株,PD-L1分子抑制活化的Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。     

浆细胞性乳腺炎的中西医结合治疗

目的:探讨中西医结合治疗浆细胞性乳腺炎的疗效.方法:对72例浆细胞性乳腺炎病人,给予内服中药"浆乳方",并配以外治法(箍围、引流、手术、乳痈扩创、挂线、冲洗、乳头矫形术)进行治疗.通过术后病理分析、疗效观察及长期随访,评估中西医内外合治对浆细胞性乳腺炎的疗效.结果:"浆乳方"联合外治法治疗浆细胞性乳腺炎,治愈率达98.61%(71/72),复发率为1.4%(1/72).结论:中西医结合治疗浆细胞性乳腺炎的治愈率较高,复发少,并能保持良好的乳房外形,值得推广.     

人源化抗体研制策略分析及应用研究

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所替代 ,人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代。本文介绍并比较分析了几种制备人源化抗体的策略和抗体表达系统 ,并对其临床应用进行了展望。     

4-1BBL逆向信号促进单核细胞的增殖和分泌细胞因子的作用

采用抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1包被 2 4孔培养板 ,加入经免疫磁珠阴性选择获得的高纯度人外周血单核细胞 ,动态观察细胞的生长状态 ,并用3 H TdR掺入法分析单核细胞增殖 ,应用ELISA动态测定培养上清中IL 6、IL 10、M CSF和FL等细胞因子水平。结果发现 1F1非常有效地促进单核细胞的增殖 ,1F1组单核细胞分泌高水平的M CSF以及IL 6和FL增加 ,但 1F1组单核细胞分泌IL 10水平低于对照组 (P <0 0 5 )。由此表明 ,抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1通过激发单核细胞 4 BBL逆向信号 ,介导单核细胞分泌M CSF、IL 6和FL。上述细胞因子联合作用 ,从而促进了单核细胞的增殖。     

人PD-L1Ig融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获取人PD L1Ig融合蛋白 ,研究其对T细胞的调节效应 ,采用PCR法从pMD18 T/PD L1中扩增出人PD L1基因的胞外段序列 ,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1Fc恒定区基因 ,两者拼接后插入逆转录病毒载体pEGZ Term ,用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染 2 93T包装细胞 ,用含病毒颗粒的培养上清反复感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选能稳定分泌人PD L1Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆之 ,经无血清培养 ,收集的上清用Dotblot检测、ELISA定量后 ,浓缩并经ProteinG柱纯化 ,再经Westernblot鉴定。以FACS分析纯化蛋白对活化T细胞表达的PD 1结合能力 ,以体外T细胞活化体系观察其对T细胞表型的调节作用。结果表明 ,成功地构建了表达人PD L1Ig蛋白的重组逆转录病毒载体 ;获得的L92 9/PD L1Ig细胞能稳定分泌人PD L1Ig蛋白 ;该蛋白与PD 1受体具有良好的结合能力 ,能抑制T细胞的进一步活化。     

两种不同的转基因细胞构建体系的比较

目的：比较目的基因在两种不同表达体系构建的转基因细胞上的表达，选择更好的构建体系。方法：脂质体法将重组真核细胞表达载体pcDNA3／PD-L1导入L920细胞，G418(600μg/ml)筛选抗性细胞株，同时将重组逆转录病毒载体pGEZ-Term／PD-L1与辅助载体共转染293T细胞，包装病毒颗粒，其上清感染L929细胞后，经Zeocin(500μg/ml)筛选抗性细胞。流式细胞仪(FCM)检测目的蛋白在两种细胞膜上的表达。结果：两种体系对目的基因的瞬时表达无明显差别；用pcDXA3构建的转基因细胞膜上目的分子表达稳定性差，表达率低，而用pGEZ-Term构建的则目的蛋白稳定高表达，表达率近100％。结论：两种构建体系均能瞬时表达目的分子，pGEZ-Term表达体系更适于构建长期稳定表达目的基因的转基因细胞。     

《医林改错》与《寿世保元》

清代王清任所著《医林改错》一书,对活血祛瘀之法造诣颇深,所立代表方剂如“血府逐瘀汤”、“膈下逐瘀汤”、“少腹逐瘀汤”、“身痛逐瘀汤”和“补阳还五汤”等,一直为后世医家所重视。考其方源,确有滥觞于《寿世保元》之例,兹举下列三方证之:一、疏肝散:黄连(吴茱萸煎炒)、柴胡、当归、