联合注射外源性IFNγ和IGF-1治疗小鼠骨骼肌损伤

目的：观察局部联合注射外源性人胰岛素样生长因子-1（human insulin-like growth factor-1，hlGF-1）和人γ干扰素（human interferon γ，hIFNγ）对于小鼠急性钝挫伤骨骼肌修复过程中再生和纤维化的影响。方法：64只8周龄雄性C3H小鼠，制作右侧腓肠肌钝挫伤动物模型，随机分为4组，即A组（注射hIFNγ）、B组（注射hIGF-1）、C组（联合注射hIFNγ和hIGF-1）、D组（注射生理盐水）。挫伤后第10天，A、B、C、D组小鼠，腓肠肌损伤处分别注射不同药物进行干预。于干预前（伤后7d），和干预后4、18、32d，各组随机抽取4只小鼠进行损伤腓肠肌取材，以荧光定量PCR和免疫荧光化学染色方法检测不同时点Ⅱb型肌球蛋白重链（myosin heavy chain—Ⅱb，MHC—Ⅱb）及波形蛋白（Vimentin）的表达。结果：④干预后各时点，B、C组小鼠损伤骨骼肌局部MHC—Ⅱb表达较A、D组明显高；（爹干预后各时间点A、B、C组小鼠损伤骨骼肌局部Vimentin表达较D组低，其中以A组和B组更明显。结论：④骨骼肌急性损伤后，局部注射hIGF-1有明显促进骨骼肌纤维再生，和一定程度抑制纤维化的作用。②局部注射hIFN3,仅表现出抑制纤维化的作用，且比hlGF-1更加明显。⑧联合应用hlGF-1和hIFNγ，能够同时促进骨骼肌再生和抑制纤维化，有效地促进损伤骨骼肌的愈合。     

人γ干扰素基因转染成肌细胞在治疗骨骼肌损伤中的应用

目的:构建转人γ干扰素(human interferonγ,hIFNγ)基因的成肌细胞,探讨hIFNγ对小鼠急性钝挫伤骨骼肌修复过程的影响。方法:①应用基因重组技术,将hIFNγ基因克隆到pEGFP-C2真核表达载体中,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pEGFP-C2-hIFNγ的正确性;②经脂质体介导转染C2C12成肌细胞,用RT-PCR和Western Blot法检测转基因细胞的hIFNγ表达。③64只7~12周雄性C3H小鼠,制作右侧腓肠肌钝挫伤动物模型,随机分成4组,即A组(注射hIFNγ),B组(注射转hIFNγ的C2C12细胞),C组(注射空白成肌细胞),D组(未干预)。挫伤后第10天,A、B、C组的小鼠,于腓肠肌损伤局部注射不同药物,D组不进行干预以作为自然愈合对照。分别于伤后7、14、28、42天,从各组中随机抽取4只小鼠进行右侧腓肠肌损伤部位取材,以荧光定量PCR和免疫荧光化学染色检测不同时间点波形蛋白(Vimentin)及Ⅱb型肌球蛋白重链(MHC-Ⅱb)的表达。结果:①酶切和测序结果均证实成功构建了hIFNγ真核表达质粒pEGFP-C2-hIFNγ,RT-PCR和Western Blot检测到转染细胞中hIFNγ基因的表达;②干预后各时间点,A、B组小鼠损伤骨骼肌Vimentin表达较C组和D组降低;伤后42天,B组损伤骨骼肌Vimentin表达低于A组,其余时间点A、B两组间无显著差异;③各组MHC-Ⅱb表达无明显差异。结论:①成功制备了含hIFNγ基因的真核表达质粒,转染后获得了高效表达hIFNγ的鼠C2C12成肌细胞;②采用转染hIFNγ的C2C12成肌细胞局部注射,可以抑制骨骼肌纤维化标志产物波形蛋白的表达,与注射外源性IFNγ的作用近似。③局部注射转hIFNγ基因的成肌细胞或外源性IFNγ,未发现对骨骼肌再生标志产物MHC-Ⅱb表达有明显影响。     

三七总皂甙对人肝癌细胞缝隙连接细胞间通讯的调节机制

目的：观察三七总皂甙对人肝癌细胞SMMC-7721缝隙连接细胞间通讯、以及缝隙连接蛋白32mRNA和磷酸化细胞外信号调节激酶1，2表达的影响。方法：实验于2005—08／2006—03在江西省分子医学重点实验室完成。①实验操作：SMMC-7721细胞用含100mg／L，200mg／L，400mg／L三七总皂甙的培养液预处理，对照组SMMC-7721细胞不加三七总皂甙。②实验评估：采用划痕标记，染料示踪技术检测缝隙连接细胞间通讯的变化；采用反转录-聚合酶链反应检测缝隙连接蛋白32mRNA水平；采用流式细胞仪检测磷酸化细胞外信号调节激酶1／2的表达。结果：①对照组染料局限于划痕两侧的细胞内，无明显的荧光染料传输，GJIC阴性；三七总皂甙可上调染料传输范围，且随三七总皂甙剂量增高，染料传输范围逐渐增大，最远可达三四层细胞。②反转录-聚合酶链反应结果显示，各组细胞缝隙连接蛋白32mRNA水平差异无显著性意义（P〉0．05）。③流式细胞仪结果显示，对照组SMMC-7721细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1／2表达的阳性率较高，伴随三七总皂甙剂量增加磷酸化细胞外信号调节激酶1／2表达的阳性率逐渐下降，呈一定的剂量依赖效应。结论：三七总皂甙可能通过抑制SMMC-7721细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1／2的活化减少缝隙连接蛋白32的磷酸化，进而上调SMMC-7721细胞的缝隙连接细胞间通讯功能。     

踝关节剥脱性骨软骨炎微骨折术后修复组织的MRI定量评估

【摘要】目的：探讨定量MRI评估踝关节剥脱性骨软骨炎（OCD）微骨折术后早期和中期软骨修复情况的临床价值。方法：2010－2012年在我院运动医学科进行微骨折治疗的踝关节OCD患者20例,在术后3~12个月（早期）及12~24个月（中期）分别进行两次踝关节MRI扫描及临床疗效评分。MRI扫描序列主要为3D双回波稳态序列（3D-DESS）、T2-mapping和T2STIR序列,分别用于测量修复组织的厚度指数、T2指数及修复区下骨髓水肿（BME）体积。采用美国足踝外科评分系统（AOFAS）评估临床疗效。采用配对样本t检验比较早期和中期修复组织的定量MRI参数（厚度指数、T2指数、BME体积）及AOFAS评分的差异,采用Pearson相关分析评估定量MRI参数与AOFAS评分的相关性。结果：微骨折术后中期修复组织的厚度指数高于早期（分别为0.813±0.104和0.687±0.123,P<0.05）,T2指数低于早期（1.109±0.171和1.392±0.174,P<0.05）,BME体积小于早期（0.646±0.70和0.992±0.924,P<0.05）;AOFAS评分高于早期（85.050±7.660和76.750±9.419,P<0.05）。厚度指数、T2指数及BME体积与AOFAS评分均存在相关性（r=0.412、－0.531和－0.357,P值均小于0.05）。结论：踝关节OCD微骨折术后损伤区逐渐填充,修复组织逐渐成熟,BME范围逐渐缩小,患者临床症状改善,定量MRI与临床疗效存在相关性。MRI3D-DESS、T2-mapping、T2STIR能从修复厚度、组织生化构成和BME等方面全面有效评估踝关节OCD微骨折术后的修复情况。     

ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响

目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响。方法:(1)设计并选择抑制效能最高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达;(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组。通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen I和α-SMA表达水平。结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P<0.05);(2)TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P<0.05);(3)TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen I mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P<0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P>0.05)。结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点。     

缝隙连接细胞间通讯在炎症、损伤修复和疾病中的作用

缝隙连接是相邻细胞间的通道结构,其主要功能是细胞通讯,又称缝隙连接细胞间通讯。缝隙连接细胞间通讯是细胞间最重要的信息交流形式,可调节组织细胞的生长、分化,在组织保持内稳态中处于核心地位。本文就缝隙连接细胞间通讯在炎症、损伤修复和疾病中的作用等方面作一综述。     

透明质酸在运动医学中的应用

透明质酸（hyaluronic acid,HA）是一种独特的线性黏多糖,广泛分布于人体各组织的细胞外基质中,具有很强的亲水性和高度的黏弹性。HA是关节滑液的主要成分,由滑膜细胞、成纤维细胞和软骨细胞分泌,在保护关节软骨中起着重要作用。目前,HA已广泛应用于运动医学领域、特别是骨关节炎治疗,同时也被用于关节扭伤、冻结肩和肩袖损伤等疾病治疗。本文就HA的理化特性及其在运动医学中的应用情况作一综述。     

TAT-CAⅢ融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能鉴定

目的:构建含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体,并进行诱导表达、纯化,在体外初步鉴定TAT-CAⅢ的跨膜转运功能。方法:采用PCR的方法扩增编码CAⅢ和TAT-CAⅢ全长的DNA序列,分别重组入pET28a质粒表达载体中,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),构建重组体的表达菌株;IPTG诱导表达后,用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化融合蛋白,纯化产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及磷酸酶活性染色;然后分别以1μmol/L纯化的CAⅢ及TAT-CAⅢ孵育C2C12成肌细胞1h,间接免疫荧光法检测两者在细胞内的分布情况。结果及结论:成功地构建了含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体;转化大肠埃希菌BL21(DE3)后表达并纯化出相对分子量分别约32 000(CAⅢ)和35 000(TAT-CAⅢ)的融合蛋白,Westernblot和酶活性染色鉴定表明成功地获得了两种融合蛋白;间接免疫荧光染色显示,TAT-CAⅢ孵育组细胞内可见有较强的绿色荧光,而CAⅢ组细胞内则未见荧光,表明TAT可介导CAⅢ由胞外跨膜转导进入胞内。     

低频电刺激过程中大鼠骨骼肌肌张力和肌电信号的变化特征

目的:探讨低频电刺激过程中大鼠骨骼肌肌张力和肌电信号的变化特征.方法:对12只雄性SD大鼠腓肠肌进行低频电刺激,采用SMUP-E型生物信号处理系统同步记录其肌张力及肌电信号的变化,并分别取刺激0、5、10、20、40min时的肌电信号和肌张力值进行比较分析.结果:(1)随刺激时间延长,腓肠肌肌张力峰-峰(P-P)值及肌张力微分值逐渐降低,与刺激开始时相比,刺激10min时即有显著性差异(P＜0.01);而疲劳指数(FI)则随刺激时间延长逐渐增加,刺激40min时高达52.14%.(2)肌电振幅P-P值及肌电图(EMG)时频指标--肌电积分(IEMG)、平均功率频率(MPF)和中位频率(MF)值均随刺激时间延长而逐渐降低.与刺激开始时相比,刺激5rain时MPF已显著降低(P＜0.05),而肌电振幅P-P值及IEMG值在刺激10min时才开始显著降低(P＜0.05);尽管MF值随刺激时间延长有所降低,但各时间点差异无统计学意义(P＞0.05).结论:低频电刺激可诱发大鼠腓肠肌疲劳,MPF在反映疲劳的敏感性方面优于IEMG.     

大强度跑台运动及低频电刺激对大鼠骨骼肌及血清CAⅢ表达的影响

目的:观察急性大强度跑台运动及低频电刺激后大鼠骨骼肌及血清CAⅢ表达的变化,探讨CAⅢ与骨骼肌疲劳之间的关系.方法:36只雄性SD大鼠随机分为对照组、运动组和刺激组.运动组参照Bedford方案进行一次大强度跑台运动,造成大鼠运动性疲劳;刺激组采用低频电刺激的方法诱发大鼠腓肠肌疲劳.Western blot检测大鼠骨骼肌及血清CAⅢ的表达水平.结果:(1)与对照组相比,运动组大鼠比目鱼肌CAⅢ的表达水平明显降低(P＜0.05),但趾长伸肌及血清CAⅢ的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).(2)随刺激时间的延长,大鼠腓肠肌的肌张力峰-峰(P-P)值逐渐降低,与刺激开始时相比,刺激10min即显著降低(P＜0.05);而疲劳指数(FI)则随刺激时间的延长逐渐增加,刺激40min时FI高达52.14%左右.(3)与对照组相比,刺激组大鼠腓肠肌CAⅢ的表达水平显著降低(P＜0.05),而比目鱼肌及趾长伸肌CAⅢ的表达水平虽均有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论:急性大强度跑台运动及低频电刺激诱发疲劳后均可引起相应骨骼肌CAⅢ表达下调(前者表现为比目鱼肌,后者为腓肠肌),表明骨骼肌疲劳的发生可能与其CAⅢ表达下调有关.