RVP Fast与实时荧光PCR/RT-PCR检测呼吸道病毒结果的比较

目的评价xTAG呼吸道病毒群快速检测(Respiratory Virus Panel Fast Array,RVP Fast)技术检测呼吸道病毒的临床应用价值。方法选取经实时荧光定量PCR/RT-PCR筛查的74份呼吸道病毒阳性和4份阴性鼻拭子标本,用RVP Fast和RTPCR同时检测78份标本的8种呼吸道病毒及其亚型(共19型),运用McNemarχ2检验,Kappa检验和线性回归方法对检测结果进行统计处理。结果两种方法检测78份标本有71份结果完全相符,包括55份单个病毒感染标本,12份混合病毒感染标本和4份阴性标本。两种方法检测结果总体比较无统计学差异(P0.05),一致性较好(Kappa=0.960,P0.01),RVP Fast荧光强度中位数(MFI)与实时荧光PCR/RT-PCR阈值循环数(Ct)呈负相关(r=-0.529,P0.01)。结论 RVP Fast芯片技术的检测性能准确可靠,可应用于国内呼吸道病毒感染的快速、高通量检测,具有推广价值。     

登革病毒重组包膜蛋白表达及其应用的研究进展

登革病毒(dengue virus,DV)是当前严重影响人类健康的虫媒传播病毒,无特效的疫苗和药物.目前在DV的诊断、疫苗的研发以及对抗体依赖性增强效应(ADE效应)机制的研究上,DV包膜蛋白越来越受到人们的关注.研究人员通过不同的载体表达不同形式的DV包膜蛋白,对研究目的以及研究结果的应用有着巨大的影响.本文主要就DV包膜蛋白在不同表达系统中的表达方式进行综述,尝试比较分析各种表达系统表达包膜蛋白的关键点以及其应用范围.     

广州地区病毒性腹泻的病原分布和病毒基因分型调查

摘要:目的　初步了解广州地区儿童和成人病毒性腹泻的病原学构成和分布情况及相关病毒的分子特征。方法　收集2012年11月-2013年5月于珠江医院就诊的腹泻患者的粪便标本,采用免疫层析法检测轮状病毒和腺病毒抗原,实时荧光PCR检测诺如病毒GI/GII,上述检测阳性标本进行病毒基因测序分型。结果　290例患者中,3种常见病毒的检出率分别为21.4%、15.5%和1.7%;男性患者病毒阳性率显著高于女性患者（χ2＝0.017,P＜0.05）;≤5岁患者轮状病毒阳性率最高,为28.49%（χ2＝0.017,P＜0.05）,＞5岁患者诺如病毒阳性率最高,为21.62%;轮状病毒性腹泻秋冬季节高发;轮状病毒G/P分型以G1P8、G9P8、G2P4和G3P8为主,占92.16%,诺如病毒共检测出8种基因型,以GII.4型为主,占53.33%;病毒合并其他常见腹泻病原体感染占病毒阳性标本的15.89%。结论　轮状病毒和诺如病毒分别是广州地区婴幼儿和成人病毒性腹泻的主要病原体,本地区流行的轮状病毒和诺如病毒优势株分别是G1P8和GII.4,诺如病毒基因型多样性更丰富;混合感染常见,需引起重视。     

建立检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种循环参数的实时荧光定量PCR

目的建立两种不同循环参数的实时荧光定量PCR,检测包括流感病毒、冠状病毒等18种(型/亚型)呼吸道病毒。方法引用文献报道的18种(型/亚型)呼吸道病毒引物和探针,建立两种不同循环参数的实时荧光定量PCR法,考核方法的敏感性、特异性和准确性,并用临床标本进行验证。结果成功建立了可检测18种(型/亚型)呼吸道病毒的两种不同循环参数的实时荧光定量PCR法;该法特异性较好,最低检测限为10拷贝数/μL,变异系数(CV)为1.26%~3.43%,重复性良好;408份临床标本中,用该法检测鼻拭子标本阳性率为63.2%(225/356),肺泡灌洗液标本阳性率为25.0%(13/52)。结论建立的实时荧光定量PCR法简便、特异、敏感、稳定,适用于临床常见呼吸道病毒感染的早期诊断。     

白念珠菌感染特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA体系的建立与评价

目的以白念珠菌Csa2蛋白为靶标,建立双抗体夹心ELISA检测体系,评价该方法的检测灵敏度和特异性。方法构建pPIC9K-Csa2重组表达载体,电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达、纯化重组蛋白rCsa2。rCsa2蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠制备免疫血清。以纯化兔多抗和豚鼠抗血清配对,利用棋盘滴定法,确定最佳实验条件,建立双抗体夹心ELISA检测系统。检测rCsa2和白念珠菌不同培养时间的上清,确定检测方法的灵敏度;检测其他3种念珠菌、5种曲霉、新型隐球菌和马尔尼菲青霉的培养上清,评价检测方法的特异性。结果成功构建表达载体并获得真核表达重组蛋白rCsa2,经SDS-PAGE鉴定相对分子质量(Mr)为13 300,符合预期值;Western blot法证实该蛋白可与特异性抗体结合。免疫动物获得高效价免疫血清,并以此成功建立双抗体夹心ELISA,可检测rCsa2蛋白的灵敏度约为240 pg/mL,并最早可检测到培养18 h的白念珠菌培养上清,与其他10种临床常见真菌的培养上清无交叉反应。结论建立了有较高的检测灵敏度和特异性的Csa2的双抗体夹心ELISA,为区别诊断白念珠菌感染提供新的方法。     

白念珠菌Csa2蛋白双抗原夹心ELISA方法的建立及诊断价值

目的 建立以白念珠菌Csa2蛋白抗体为靶标的双抗原夹心ELISA,初步评价其鉴别诊断白念珠菌尿道感染的应用价值。方法 通过间接免疫荧光染色定位Csa2蛋白在白念珠菌菌体分布情况;应用棋盘滴度法优化反应条件,建立双抗原夹心ELISA并进行方法学评价;检测324例健康体检者血清,确定该方法的cutoff值;检测120例健康体检者及30例念珠菌属尿路感染患者血清,分析其诊断的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。结果 Csa2蛋白是一种特异性分布在白念珠菌菌丝态表面的蛋白;以0.1 μg/mL的rCsa2蛋白为包被抗原,1∶1 000稀释的rCsa2-HRP蛋白为检测抗原,建立双抗原夹心ELISA,可最低检测1∶16 000稀释的rCsa2蛋白免疫兔血清并不与正常兔血清发生反应;该方法的cutoff值为0.072,诊断白念珠菌尿路感染敏感性为65.2% (15/23),特异性为98.4% (125/127),阳性预测值88.2%（15/17）,阴性预测值为94.0%（125/133）。结论 成功建立检测白念珠菌特异性Csa2蛋白抗体双抗原夹心ELISA;初步评价该方法对诊断白念珠菌尿路感染具有较高的特异性,得出较高阳性预测值和阴性预测值;Csa2抗体靶标对区分白念珠菌感染和定植具有一定价值。     

基于质谱技术的尿液代谢组学在膀胱癌生物学标志物挖掘中的研究进展

膀胱癌是我国常见的泌尿系肿瘤,但目前的诊断手段在早期诊断方面还有所不足,若能早期及时治疗,对提高膀胱癌患者的五年生存率有重大意义。质谱技术作为一种“指纹图谱”,在新的肿瘤标志物的挖掘中具有广泛的应用前景,而肿瘤是一种始于线粒体代谢障碍的疾病,又因尿液与膀胱接触时间较长,故而是探索新的膀胱癌生物学标志物最为理想的样本之一。该文就基于质谱技术的尿液代谢组学在膀胱癌生物标志物挖掘中的研究进展作一综述。     

西尼罗河病毒NS1的克隆、表达及抗原性分析

目的克隆和表达西尼罗河病毒（WNV）非结构蛋白1（NS1）,并分析其与登革病毒NS1的抗原交叉反应性。方法合成WNV NS1全基因序列,将NS1全基因克隆到pGEX-5X-3原核表达载体中表达GST—NS1融合蛋白,用4型登革病毒免疫血清及登革病毒NS1单克隆抗体并应用Western Blot方法分析WNV—NS1重组蛋白的抗原性。结果重组质粒pGEX-5X-3-WNV—NS1经IPTG诱导,高效表达GST-NS1融合蛋白,经变性纯化和复性获得可溶性WNV-NS1重组蛋白,经WesternBlot证实WNV—NS1重组蛋白可与各型登革病毒免疫小鼠血清及部分4型登革病毒NS1交叉单抗识别。结论成功获得可溶性WNV—NS1重组蛋白,该蛋白与登革病毒NS1具有抗原交叉反应性,其结果为建立西尼罗河病毒的血清学诊断和鉴别诊断奠定了基础。     

IgG 型抗登革病毒NS1 抗体介导被动系统性过敏反应的研究

目的:明确登革病毒玉型(Dengue virus serotype 1,DENV1)非结构蛋白1(Non-structure protein 1, NS1)与其IgG 型抗体的免疫复合物(Immune complexes,ICs)能否诱导机体产生被动系统性过敏反应(Passive systmic anaphylaxis,PSA),为阐明登革出血热与登革休克综合征(DHF/ DSS)的发病机制提供依据。方法:从本课题组现有的多株抗NS1 单克隆抗体中,筛选能够与纯化NS1 结合并形成免疫复合物进而诱导小鼠产生被动系统性过敏反应(PSA)和被动皮肤过敏反应(Passive cu-taneous anaphylaxis,PCA)的单抗或单抗组合;并观察体内氯化钆(GdCl3 )和血小板活化因子受体(PAFR)拮抗剂CV-3988 处理对PSA 的影响。结果:用亲和层析纯化的DENV1 NS1,从本室制备的20 株IgG 型抗DENV1 NS1 单抗中仅筛选出2 组单抗组合制备免疫复合物(NS1-IgG ICs)能成功诱导小鼠的PCA 和PSA 反应,而其他抗体或抗体组合并无此反应;用GdCl3 抑制单核巨噬细胞或CV-3988 阻断PAFR 处理可抑制或减轻小鼠PSA 反应。结论:DENV1 NS1 结合两个IgG 型单抗组合的免疫复合物可诱发PSA 与PCA,但并非所有的抗NS1 单抗或抗体组合与NS1 结合都能诱发PSA,推测与识别表位不同有关;初步证明DENV1 NS1-IgG ICs 诱发PSA 的主要效应细胞是巨噬细胞,主要效应分子是PAF。