碳青霉烯类敏感性下降革兰阴性杆菌 NDM-1基因筛查

目的：检测碳青霉烯类敏感性下降革兰阴性杆菌的新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)基因,了解广州地区 NDM-1超级细菌的流行情况。方法收集2011~2014年分离的碳青霉烯类敏感性下降革兰阴性杆菌105株,采用聚合酶链反应(PCR)扩增 NDM-1基因保守序列初步筛查 NDM-1基因,阳性菌株扩增 NDM-1基因全序列,然后克隆至 pUCm-T 质粒后进行测序。结果肠杆菌科细菌对美罗培南、厄他培南、亚胺培南的耐药率分别为29.09%、50.91%、29.09%;鲍曼不动杆菌对美洛培南、亚胺培南全耐药;铜绿假单胞菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率均为88.46%。有4株菌含 NDM-1基因,包括肺炎克雷伯菌1株,大肠埃希菌2株,阴沟肠杆菌1株;克隆质粒 pUCm-T-NDM-1经双酶切和测序证实构建成功。测序结果经 BLAST 比对后,发现4个克隆质粒的序列100%相同,与国内外发现的 NDM-1序列也是100%一致。结论该地区革兰阴性杆菌存在产 NDM-1酶株,其所携带的 NDM-1基因全序列与国际上发现的完全一致。     

ARMS 法在检测肺癌晚期患者肿瘤组织和血浆表皮生长因子受体基因突变中的应用

目的：应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（ ARMS－PCR）检测晚期肺癌患者血清游离DNA和肿瘤组织中表皮生长因子受体（ EGFR）基因突变,探索两者间的一致性。方法同时收集53例未经治疗的肺癌Ⅲb～Ⅳ期患者的原发灶肿瘤组织和外周血,分别提取DNA,采用ARMS－PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和21外显子突变,对结果不一致的标本用微滴式数字PCR法对外周血标本进行验证。结果血浆EGFR基因突变检测的灵敏度为51.4％（17／33）,特异度为100％;血浆EGFR基因的突变率为29.4％;16例血浆和组织结果不一致的标本,数字PCR检测的结果与血浆游离DNA检测的结果一致。结论血浆游离DNA为监测Ⅲb～Ⅳ期肺癌患者原发肿瘤中EGFR基因突变提供了新的来源, ARMS法是检测血浆游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。     

CTX—M型阴沟肠杆菌的基因克隆及原核表达产物特性研究

目的对阴沟肠杆菌所产CTX-M型β-内酰胺酶进行基因克隆、原核表达重组质粒的构建及其特性研究。方法以产CTX-M型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌45号基因组DNA为模板,设计两对引物PCR扩增CTX-M,将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列,再将CTX-M基因克隆到pGEX-6P-3表达质粒并转入感受态BL21,选择阳性菌落进行药物敏感试验和酶动力学检测。结果PCR扩增出大小为876bp和1067bp的基因片段,与GenBank上CTX-M-9和CTX-M-3酶的基因序列同源性为100%。CTX-M-3型重组菌株药敏试验结果与原菌株相比,对青霉素类和头孢噻肟具有明显的水解作用,第三、四代头孢菌素对之较为稳定,动力学结果与酶稳定性结果基本一致。结论重组质粒pGEX-6P-3/CTX-M构建成功,CTX-M-3型重组菌株与原菌株比较,对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加,亲和力下降。     

2型糖尿病合并冠心病患者白细胞介素6、超敏C反应蛋白及血脂、血糖的相关性研究

目的探讨2型糖尿病(T2DM)合并冠心病患者的白细胞介素-6(IL-6)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)及血脂、血糖的关系。方法选取2014年1～11月来该院就诊经首次诊断为T2DM合并冠心病患者64例,单纯T2DM患者56例,体检健康者58例。检测各组IL-6、hs-CRP、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白-C(LDL-C)、空腹血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)水平并研究其在不同人群间的相关性。结果 T2DM组和T2DM合并冠心病组空腹血糖、HbA1c、TC和LDL-C比健康对照组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);T2DM合并冠心病组患者的IL-6、hs-CRP水平显著高于T2DM组,T2DM组患者的IL-6、hs-CRP水平显著高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 IL-6和hs-CRP可作为预测T2DM合并冠心病患者疾病进程的较为特异的指标。     

广州地区儿童肺炎支原体核酸检测阳性病例的分析

目的分析该地区儿童肺炎支原体核酸(MP-DNA)检测阳性病例的临床特征,为临床诊断和治疗儿童肺炎提供依据。方法对广州医学院荔湾医院和广州医科大学附属第一医院2014-2015年门诊及住院患者中有呼吸道感染症状者,进行咽拭子采样,提取DNA后用聚合酶链反应法检测MP基因,同时抽血检测血常规和肺炎支原体抗体。结果 2 018例呼吸道感染患儿中MP-DNA阳性209例,阳性率10.36%。3~14岁年龄组MP-DNA阳性率为18.25%,均高于其他年龄组,差异具有统计学意义(P0.05);7-9月份阳性率为16.11%,均高于其他月份组,差异具有统计学意义(P0.05);女性阳性率为13.04%,明显高于男性的8.79%,差异具有统计学意义(P0.05);MP-DNA阳性患者白细胞计数偏高占22.01%,白细胞计数正常内占49.28%,白细胞计数偏低占28.71%;MP-DNA阳性患者血清MP-IgG检测中阳性146例,占69.86%。结论 MP-DNA检测对小儿呼吸道感染诊断有重要价值,进行多项目及时快速地检测,对预防该疾病加重有重要意义。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及纯化

目的对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行基因重组表达及纯化。方法以产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌总基因组DNA为模板PCR扩增CTX-M-3,将其克隆入pET-28a(+)载体,重组质粒转入大肠埃希菌ER2566中表达,表达产物经过Ni-琼脂糖凝胶柱纯化,用SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定纯化蛋白。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。此基因能在大肠埃希菌ER2566中大量表达,蛋白分子质量大约为32KD得到SDS-PAGE电泳和Western-blot的证实,与理论值相符。结论成功表达及纯化CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶,为进一步酶生物学特性及酶的抗体制备研究奠定了基础。     

革兰阴性杆菌产β-内酰胺酶及其耐药分子机制的研究

目的分析革兰阴性杆菌所产β-内酰胺酶的表型及基因分型,并研究其耐药分子机制。方法用纸片扩散初筛试验、扩散确证试验进行超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases,ESBLs）表型检查,头孢西丁三维试验进行AmpCβ-内酰胺酶的表型检查,纸片协同试验筛选产金属β-内酰胺酶（metallo-beta-lactamase,MBL）菌株;用多重PCR技术扩增β-内酰胺酶基因并进行DNA测序;用PCR技术扩增基因元件整合子、插入序列ISEcp1B和转座子tnpU;用MIC药敏法分析革兰阴性杆菌的药物敏感性。结果①革兰阴性杆菌β-内酰胺酶的表型总检出率为24.28%（42/173）,主要由单产ESBLs引起,占13.29%,β-内酰胺酶的基因型总检出率为24.86%;②整合子检出49株占28.32%,ISEcp1B插入序列检出29株占16.76%,转座子tnpU检出28株占16.18%,基因元件阳性的菌株大多数β-内酰胺酶表型为阳性;③β-内酰胺酶阳性菌株对抗生素的耐药率显著高于阴性菌株。结论革兰阴性杆菌可携带多种β-内酰胺酶,基因元件广泛分布于革兰阴性杆菌中,可能在多重耐药机制中起重要作用。