美丽鲜花的隐患

鲜花一直是美丽的象征，在看望病人时，送上一束美丽的鲜花，这早已成为一种时尚。可是，当人们带着这种美好的祝福去医院看望病人的时候，却往往会被医生、护士礼貌地拒之门外。人们百思不得其解，这背后究竟有着怎样的玄机呢？     

帕博西尼逆转人食管鳞癌奥沙利铂耐药细胞株耐药性的研究

  目的  建立人食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)耐药细胞株KYSE150-OXA,研究细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinase 4/6,CDK4/6)抑制剂帕博西尼(palbociclib)对耐药细胞株耐药性的逆转及其机制。  方法  CCK-8检测耐药细胞对奥沙利铂、紫杉醇(paclitaxel,PTX)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以及CDK4/6抑制剂palbociclib的耐药性;流式细胞术检测化疗药物对耐药细胞凋亡和周期的影响;Western blot检测细胞中多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)及细胞周期相关蛋白的表达量;CalcuSyn软件计算palbociclib与L-OHP联合用药对细胞增殖的作用。  结果  成功建立人体外ESCC L-OHP耐药细胞株KYSE150-OXA,耐药指数(resistance index,RI)为11.23±0.59,耐药细胞KYSE150-OXA对PTX和5-FU也表现出耐药性,Western blot结果显示耐药细胞中MDR1蛋白表达升高(4.46±0.22)倍;与亲本细胞KYSE150相比,耐药细胞株G1期细胞显著增多,且CDK4、CDK6及Cyclin D1表达显著升高;palbociclib增加KYSE150-OXA对L-OHP的敏感性;低浓度palbociclib与L-OHP表现出拮抗作用,高浓度时表现为协同作用;palbociclib处理组细胞中磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(phospho-retinoblastoma,pRb)降低(91±2)%及细胞周期蛋白A(Cyclin A)降低(89±6)%。  结论  成功建立人体外ESCC L-OHP耐药细胞株KYSE15 0-OXA;palbociclib可能通过抑制异常激活的Cyclin D-CDK4/6-pRb信号通路逆转耐药细胞对L-OHP的耐药性。      

LETM2在食管鳞癌中的表达及其作用

  目的  探讨LETM2在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的表达,研究LETM2对ESCC细胞系KYSE150和ECA109增殖和侵袭迁移的影响。  方法  免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测90例ESCC及癌旁组织LETM2蛋白表达差异,RT-PCR和Western blot检测ESCC细胞系LETM2表达情况,慢病毒敲低KYSE150和ECA109细胞中LETM2表达。MTT和克隆形成技术检测LETM2对ESCC细胞增殖和克隆形成能力的影响,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell法分析LETM2敲低后细胞迁移侵袭能力的差异。  结果  在ESCC组织中LETM2的表达显著高于癌旁组织,LETM2通过抑制ESCC细胞G₁期向S期转化进而抑制细胞增殖,但对侵袭和迁移能力影响不大。  结论  LETM2可能作为驱动基因促进ESCC的发生发展,是ESCC的关键遗传变异,可能作为ESCC早诊早治的分子标志物。      

RNA干扰CysLT2R对LTC4介导的人乳腺癌细胞生物学行为的影响

  目的   观察MCF-7细胞低表达半胱氨酰白三烯Ⅱ型受体(CysLT2R)对半胱氨酰白三烯(LTC4)介导的细胞生长、侵袭能力、细胞周期和凋亡等生物学行为的影响。   方法   针对CysLT2R的已知cDNA序列, 设计并体外转录合成4条特异性shRNA, 用脂质体介导转染入MCF-7细胞48 h, 同时设阴性对照组(1条非特异性序列转染)、正常MCF-7对照组(未转染)。Western blot检测干扰后CysLT2R蛋白表达水平下调的变化。应用噻唑蓝比色(MTT)法检测50 nM LTC4作用下细胞株生长能力; 应用流式细胞仪检测50 nM LTC4作用下细胞周期和凋亡变化; 应用趋化小室检测50 nM LTC4作用下MCF-7细胞侵袭运动活性。   结果   与正常MCF-7细胞和阴性对照组比较, MCF-7细胞CysLT2R低表达组的细胞生长增殖无明显变化(P > 0.05), 干扰后, MCF-7细胞表现出侵袭活性明显增强(P < 0.05), 细胞周期和凋亡无明显变化。   结论   CysLT2R在人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭过程中起着一定的作用, CysLT2R有可能是一种新的乳腺肿瘤抑制基因。      

纤维连接蛋白1的原核表达、纯化及抗体的制备

目的构建人纤维连接蛋白1（FN1）基因的原核表达载体,诱导其表达并纯化该蛋白,制备特异性抗体。方法利用RT—PCR方法扩增人FN1编码序列450bp的片段,包含FN1羧基端的150个氨基酸。构建原核表达质粒pRSETA2-FN1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,FN1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过Ni^2＋-NTA树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组化检测其特异性。结果成功构建重组质粒pRSETA2-FN1,限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序均显示插入片段正确。SDS—PAGE凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为20000（FN1-His标签）,与预期结果一致。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价约为1：10000,Western blot显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系HepG2全细胞裂解液中相对分子质量约250000的纤维连接蛋白。免疫组织化学可显示FN1在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。结论成功地原核表达了FN1C-末端蛋白,并免疫获得了抗FN1特异性抗体。     

CDCA7基因在食管鳞癌细胞系中的表达及其对细胞增殖凋亡的影响

目的明确CDCA7基因在食管鳞癌各种细胞系中的表达量及其对细胞表型的影响。方法 (1)实时聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法检测食管鳞癌细胞系及永生化食管上皮细胞系中的CDCA7基因的表达水平;(2)构建CDCA7基因的敲除载体pLKO.1-purosh RNA-CDCA7;(3)将pLKO.1-puro-sh RNA-CDCA7和对照空载体pLKO.1-puro转染到内源性高表达CDCA7基因的食管鳞癌细胞系ECA109中;(4)用real-time PCR和蛋白质印迹法验证筛选出的单克隆细胞;(5)四甲基偶氮唑盐(MTT)试验、克隆形成试验、细胞凋亡试验验证CDCA7基因敲除后对细胞表型的影响。结果 (1)在食管鳞癌的各种细胞系中,ECA109是内源性高表达CDCA7基因的细胞系之一;(2)成功构建了pLKO.1-puro-sh RNA-CDCA7的敲除质粒,并筛选出稳定敲除CDCA7基因的单克隆细胞株;(3)MTT、克隆形成试验结果显示,敲除CDCA7基因可以降低食管鳞癌细胞的增殖能力和克隆形成能力;(4)细胞凋亡试验结果显示,敲除CDCA7基因能够加速食管鳞癌细胞的凋亡。结论 CDCA7基因的敲除能够对食管鳞癌细胞系的细胞表型产生影响,会抑制癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,加速癌细胞的凋亡。     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法构建原核表达质粒pGEX-5X-1．PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清。以间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价,Westernblot鉴定抗体特异性及检测PIWIL4在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位。结果成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白。免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1：20000,Westernblot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位。结论PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWIL4的生物学功能奠定了基础。     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法 构建原核表达质粒pGEX-5X-1-PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清.以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测PIWILA在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位.结果 成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白.免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:20 000,Western blot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位.结论 PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWILA的生物学功能奠定了基础.     

食管鳞癌细胞自分泌白介素-32通过诱导上皮间质转化促进肿瘤恶性表型

目的:探讨食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞自分泌的白介素-32（interleukin-32,IL-32）对细胞恶性表型的影响及其可能机制。方法:分析ESCC组织和正常组织中IL-32表达量差异,检测不同ESCC细胞系中IL-32表达;在高表达细胞中利用siRNA敲低IL-32表达,在低表达细胞系中过表达IL-32;通过MTT、Transwell实验等检测IL-32对ESCC细胞增殖、侵袭、迁移等表型的影响;Western blot检测上皮间质转化相关基因的表达变化。结果:ESCC组织中IL-32的表达量显著高于正常组织,ESCC细胞系中IL-32的表达量显著高于食管上皮永生化细胞系Het-1A;敲低IL-32显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,过表达IL-32促进ESCC细胞的恶性表型;Western blot结果显示IL-32促进ESCC细胞发生上皮间质转化。结论:ESCC细胞自分泌的IL-32可能通过促进ESCC细胞发生上皮间质转化从而发挥促癌作用,抑制IL-32可能成为治疗ESCC的一种方法。     

MUC15和PI3K/Akt 表达与胃癌临床病理特征及预后的相关性研究

目的:探讨MUC15 和PI 3K/Akt的表达与胃癌临床病理特征和预后的关系。方法:采用组织芯片和免疫组织化学法检测144 例胃癌组织及对应癌旁组织中MUC15、Akt的表达。结果:MUC15在胃癌中阳性表达率为79.8% ,高于癌旁组织中的阳性表达率22.2%（P < 0.01）;Akt在胃癌中阳性表达率为80.6% ,高于癌旁组织的阳性表达率16.7%（P < 0.01）。 MUC15和Akt表达均与胃癌分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移和TNM 分期相关（P < 0.05）;且胃癌组织中MUC15表达和Akt表达呈正相关（P = 0.001）。 单因素生存分析显示,MUC15和Akt高表达均与生存时间呈负相关（P < 0.05）。 Cox 多元回归分析提示,MUC15和Akt同时阳性的胃癌患者预后更差（HR= 3.115,P < 0.05）。 结论:MUC15可能通过PI 3K/Akt细胞信号转导通路参与胃癌的发生、发展、浸润转移,MUC15结合Akt是胃癌预后强有力的预测因子。