GFP mRNA在树突状细胞中的转染及其影响因素分析

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)mRNA在树突状细胞(DC)中的转染及其影响因素。方法:选用gfp报告基因,在体外利用含T7RNA聚合酶的mMESSAGERNA转录试剂盒,合成含有帽子结构的GFPmRNA,通过酵母多聚A聚合酶加尾,制备结构完整的GFPmRNA。与此同时,从人的外周血液中分离单核细胞,并在体外经GM-CSF和IL-4刺激分化为DC。通过转染试剂介导将合成的GFPmRNA转染到DC内并使其表达。采用流式细胞术检测其转染效率和表达水平。结果:体外合成GFPmRNA,经转染试剂介导,实现了gfp基因在DC中的表达。不同的转染试剂、mRNA用量和细胞密度对mRNA的转染效率有较大的影响。采用Transmes-sengerTransfectionKit转染试剂,1μgGFPmRNA在200μLX-VIVO-15无血清培养基中的转染密度为2.5×109/L的DC,可获得较好的转染效果(转染效率达27%以上)。结论:在适当的条件下,通过mRNA转染DC可获得较高的转染效率。     

人扁桃体淋巴细胞的分离及其表型分析

目的建立人扁桃体淋巴细胞的分离培养方法，研究淋巴细胞的表型分布，为外周淋巴细胞的研究提供实验数据。方法通过临床外科手术摘除人的扁桃体组织，经过切割、刮细胞、裂解红细胞、过滤和Fieoll梯度离心等分离过程制备扁桃体混合淋巴细胞，通过荧光抗体标记和流式细胞术对混合淋巴细胞亚群的表型CD19、CD4、CD8、CD14、CD83进行分析。结果在所分离的细胞中，CD19表型的B淋巴细胞约占细胞总数的50％以上；T淋巴细胞约占30％，其中辅助T细胞(CD4)和溶细胞T细胞(CD8)分别占细胞总数的24％和7％，CD4／CD8值约为3；CD14表型的细胞(主要是单核细胞、巨噬细胞)约占总细胞数的20％以上。CD83表型的细胞(主要是成熟的树突细胞和部分B细胞)占总细胞数的7％左右：同时还观察到在体外培养过程中，混合淋巴细胞的形态和表型分布均发生一定的变化。结论本文研究和建立的扁桃体淋巴细胞的分离培养方法操作简单，制备的淋巴细胞具有较长的存活时间。通过表型分析证明，扁桃体淋巴细胞主要以B细胞为主，其次为T细胞。在培养过程中表现分布均发生一定的变化。     

人GM-CSF基因的克隆及其稳定表达细胞系的建立

目的研究和建立人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（gramulocyte／macrophase colony-stimulating factor,GM—CSF）造血生长因子的高效表达细胞系,以降低生产成本。方法GM—CSF cDNA基因的扩增采用RT—PCR方法;基因转移采用电转移方法;细胞系采用小鼠B淋巴细胞系（L1／2）;表达产物鉴定采用Western blotting、ELISA及其生物活性测定方法。结果将扩增出的GM-CSF cDNA克隆到pcDNA3．1A载体上,构建成GM—CSF基因的重组表达载体（pcDNA—GMCSF）;经电转移将GM—CSF cDNA转移L1／2细胞中,通过G418的筛选,得到稳定表达重组人GM—CSF的细胞系。经过分析证明表达的重组人GM-CSF具有生物学活性,平均表达水平可达850ng／10^6细胞。结论本文建吐的细胞系能够高效表达具有生物学活性的重组人GM—CSF。     

腺病毒载体介导gfp基因在树突细胞的转导及其影响因素的分析

目的：研究腺病毒载体介导外源基因在人树突细胞转染的有效方法。方法：绿色荧光蛋白（gfp）报告基因重组腺病毒的构建采用直接连接法。人树突细胞的制备通过分离人外周血单核细胞，然后在体外经过诱导过程再生。结果：经腺病毒介导实现了gfp基因在树突细胞的转导和表达。病毒滴度对转导效率影响较大，只有使用高滴度（MOI〉100）的重组腺病毒才能获得较高的转导效率（40％以上）；脂质体和多聚赖氨酸可以明显提高转导效率（提高50％左右）。转导效率最高可达65％左右。结论：由腺病毒介导进行树突细胞的转基因需要较高的病毒滴度；脂质体和多聚赖氨酸可以提高基因的转导效率。