DMSO增强原核表达TAT-EGFP（Apoptin）穿膜效应的研究

目的：构建pET15b-TAT-EGFP和pET15b-TAT-Apoptin,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的定位及TAT-Apoptin的诱导Caski凋亡活性。方法：人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET15b后再连接EGFP和Apoptin基因,组成pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子。转化大肠杆菌,1mMIPTG诱导TAT-EGFP（Apoptin）融合蛋白表达,His亲和层析柱纯化。培养的Caski细胞经过10%DMSO处理1h后,加入融合蛋白孵育1h,观察TAT-EGFP进入细胞的情况。同时用TUNEL检测TAT-Apoptin诱导Caski凋亡的情况。结果：成功地构建了高表达pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子,纯化了分子质量约为30KD的融合蛋白TAT-EGFP和17KD的TAT-Apoptin融合蛋白,并在体外培养的Caski细胞经10%DMSO处理后证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力明显增强。结论：通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了DMSO能够增强TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

钙网蛋白与肿瘤免疫关系的研究进展

钙网蛋白(CRT)是一种高度保守的内质网Ca2+结合伴侣蛋白,除了维持细胞内Ca2+平衡及负责糖蛋白的折叠外,还参与线粒体代谢、基因表达和细胞凋亡等过程。蒽环类化疗药物处理时,肿瘤细胞引起的内质网应激能导致肿瘤细胞内CRT的外翻,外翻的CRT可有效增强抗原提呈细胞对肿瘤细胞的识别与吞噬,由此引发抗同种肿瘤细胞的免疫杀伤效应,诱导肿瘤免疫原性细胞进入凋亡程序。由此说明,CRT是引起肿瘤细胞免疫原性凋亡的关键因子,其在肿瘤免疫治疗过程中具有潜在的应用价值。现就CRT在肿瘤免疫中的作用进行综述。     

肿瘤归巢肽及其在肿瘤靶向治疗中的应用

肿瘤归巢肽(THPs)是一类对肿瘤组织或血管具有归巢效应的多肽,它能识别和结合肿瘤组织或血管表面的特异性受体或标志物.除了原位肿瘤,THPs还能识别并结合血管源性或转移性肿瘤.因此,THPs可将抗肿瘤药物直接靶向递送至肿瘤组织、细胞中,能够减少或消除药物耐受及毒副作用.本文将综述迄今人们对THPs的认识、开发及其在抗肿瘤诊断及治疗应用中所取得的进展.     

pET15b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体的构建、表达及其意义

目的：HCTP（HPV tansformed cervical cancer cell targeting penetratin HCTP）是新近发现的一种能特异性识别并穿透HPV转化宫颈癌细胞胞膜的短肽。构建HCTP与绿色荧光蛋白（GFP）、凋亡素（Apoptin）的重组表达载体，原核系统表达并纯化出GFP-HCTP、Apoptin-HCTP融合蛋白，研究HCTP的特异性靶向穿膜效应。方法：根据美国NIH基因库收藏的Apoptin基因序列，利用多重PCR技术拼接出Apoptin cDNA、运用PCR方法以pEGFP-C1质粒为模版扩增获得GFP cDNA片段，将Apoptin及GFP cDNA分别与退火形成的HCTP双链连接并克隆至原核表达载体pETl5b，成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP重组表达载体。DNA测序证实重组构建无误，用上述两个重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）．以IPTG诱导融合蛋白表达并用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化试剂纯化，获得可溶性基因重组融合蛋白GFP-HCTP和Apoptin-HCTP。运用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定目的蛋白。结果：成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体，经表达、纯化制备了GFP-HCTP和Apoptin-HCTP基因重组融合蛋白。结论：我们使用基因工程技术，经原核表达系统表达制备的GFP-HCTP和Apoptin-HCTP融合蛋白将为进一步研究HCTP的特异穿膜效应以及探讨HCTP作为宫颈癌治疗药物的靶向运送载体提供实验基础。     

人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达

目的 将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18, HPV18) E2基因插入到原核表达载体pET28a( )T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a( )-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础.方法 1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a( )中,构建重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2;2) PCR、限制性内切酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a( )-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达.结果 1) PCR、限制性内切酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2的成功构建;2) SDS-PAGE电泳分析, HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符.结论 1)成功构建了原核表达载体pET28a( )-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白.     

分子诊断技术在临床病毒学诊断中的应用

由于分子生物学技术的飞速发展,过去仅限在分子病毒学基础理论研究中所采用的各项技术,正在成为常规的分子诊断技术而应用于临床。在临床病毒学诊断方面,分子诊断技术为我们从各种标本中直接检测出病毒特异性基因提供了经济、简便可靠的方法。一、核酸杂交技术传统的病毒学检测方法主要有细胞培养、动物接种以及后来发展起来的电镜技术,都因为设备要求高和费时费事而仅局限     

糖类高渗化合物对TAT穿膜效率的影响

目的研究糖类高渗化合物葡萄糖、蔗糖或甘露醇预处理细胞对TAT穿膜效率的影响。方法人工合成荧光标记多肽TAT-FITC和无意义肽NCO-FITC,将其作用于体外培养的人宫颈癌细胞株Siha、小鼠成纤维细胞L929及人肝癌细胞株HepG2。荧光酶标仪定量检测不同预处理对各细胞摄取荧光标记短肽的影响及内吞抑制药阿米洛利对不同预处理后TAT穿膜的影响;荧光显微镜观察不同预处理后,TAT-FITC的穿膜效率及其在Siha细胞内的定位;MTT检测不同预处理对Siha细胞存活率的影响。结果糖类高渗化合物预处理细胞后,TAT-FITC可高效穿膜进入细胞内,且在胞浆、胞核中均匀分布,胞核浓度高于胞浆浓度;未见NCO-FITC穿膜进入细胞。0.6mol·L-1葡萄糖预处理后,细胞摄取TAT-FITC的荧光强度较0.6mol·L-1蔗糖预处理后相近且较对照组明显增强(P<0.01),0.5mol·L-1甘露醇预处理的荧光强度次之。加入阿米洛利后,糖类高渗化合物预处理的细胞摄取TAT-FITC荧光强度均明显减弱(P<0.01)。MTT数据显示适当浓度的糖类高渗化合物对细胞的活力有轻微影响。结论0.6mol·L-1葡萄糖或0.6mol.L-1蔗糖或0.5mol·L-1甘露醇预处理均可提高TAT对培养细胞的穿膜效率,但对细胞活力影响较小;预处理后细胞可能以内吞方式摄取TAT-FITC短肽。     

肝星状细胞的可塑性及其对肝纤维化的意义

在肝纤维化形成过程中,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)发挥着重要的作用.基础和临床研究结果显示,在特殊的内环境因素的影响下HSC具有朝多方向分化的潜能.对HSC命运的干预能够在一定程度上预防肝纤维化的发生,甚至逆转肝纤维化,因此HSC的可塑性研究可能为慢性肝病治疗开辟一条新途径.本文就HSC的起源、结构、可塑性及其对肝纤维化的潜在治疗意义作一综述.     

gremlin与肝纤维化

肝纤维化是多种慢性肝病共有的病理改变,目前的研究表明其发生的关键是肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的激活.HSC激活后产生大量间质胶原,导致细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)的形成与降解失衡,最终形成肝纤维化.抗肝纤维化治疗的研究虽有一定进展,但许多方法尚处于体外或动物实验阶段,有待进一步的研究解决.许多新的分子在肝纤维化中的作用也正在不断被认识,阐明,并将指导人们探索更多更有效的抗纤维化治疗途径.新近研究提示,BMP拮抗剂gremlin分子可能与机体组织纤维化病变相关,本文就gremlin、肝纤维化的最新研究作个介绍.     

展示技术在细胞膜穿透肽筛选、鉴定中的应用

以展示技术筛选不同功能的细胞膜穿透肽（CPP）是近年的研究热点。目前使用最广泛的展示技术是噬菌体展示和mRNA展示技术。本文将对噬菌体展示和mRNA展示技术的原理、方法和应用研究作一综述,并对近年来展示技术在筛选、鉴定CPP所取得的进展进行回顾和总结。