可诱导表达BMP4的正常来源及隐睾特异性iPSCs的建立及分化研究

目的建立可诱导表达骨形态发生蛋白质4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的正常来源及隐睾特异性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),比较两者体外定向分化的差异,为研究部分隐睾患儿成年后不育的原因提供具有人类遗传背景的体外研究模型。方法①建立可诱导表达BMP4的正常来源及隐睾特异性iPSCs,将正常来源iPSCs作为对照组,隐睾特异性iPSCs作为隐睾组;利用多西环素(doxycycline,Dox)进行诱导,筛选出BMP4表达量最高的细胞株;②将外源性添加BMP4的正常来源iPSCs作为外源性添加BMP4组(外源组),将Dox内源诱导BMP4表达的正常来源iPSCs作为Dox内源诱导BMP4表达组(内源组),此两组共同作为实验组;在细胞形态和基因表达水平比较实验组两组间BMP4因子诱导效果的差异;③通过Dox诱导BMP4的表达、双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)、全反式维甲酸(all trans retinoid acid,ATRA)组成的三步法诱导分化方案,逐步诱导人的正常来源及隐睾特异性iPSCs向生精细胞方向分化,在基因及蛋白水平进行检测,比较两株细胞在分化过程中的差异。结果①经Dox诱导后,在正常来源及隐睾特异性iPSCs两株细胞中均可检测到BMP4表达明显升高、同时多能性基因OCT4的表达均呈明显下降趋势,与d0相比差异具有统计学意义,其中对照组的3#细胞株与隐睾组的5#细胞株在Dox诱导后BMP4表达量最高;②与外源组相比,内源组的细胞株形态变化更为均一、同步,BMP4的基因表达量更高,两组间的差异具有统计学意义;③在向生精细胞诱导分化过程中,对照组及隐睾组细胞的DAZL和PRDM1的表达量在两组之间的差异均无统计学意义;隐睾组的VASA、SYCP3、ACROSIN和TEKT1的表达量于诱导d14和d21时均明显低于对照组,两组之间的差异具有统计学意义。免疫染色结果显示:DAZL的阳性率在对照组和隐睾组细胞间的差异无统计学意义;隐睾组的VASA和SYCP3的阳性率于诱导d14和d21时均明显低于对照组,ACROSIN的阳性率于诱导d21时明显低于对照组,差异均具有统计学意义。结论本研究为部分隐睾患儿成年后不育的原因提供了具有人类遗传背景的体外研究模型,为未来的进一步研究奠定了良好基础。     

疾病特异性iPS细胞的研究进展和在小儿外科领域的应用展望

人体发育是由受精卵基因组按照特定时空顺序进行选择性的表达和调控而成.胚胎发育的早期阶段是器官发生的关键时期,各种遗传和环境的异常改变常会造成各种身体外形或内脏结构、功能的先天性畸形,但由于伦理和技术的限制,很难对这一早期阶段的发育过程进行在体研究.因此,寻找合适的研究模型,用于研究人类胚胎早期发育异常造成的先天性畸形的发病机制至关重要.     

羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞向血管内皮细胞的体外诱导分化

背景:已证实将血管内皮细胞与具有良好组织相容性的生物材料复合,并移入体内后可增殖分化形成血管.但由于获取内皮细胞时创伤较大,所以细胞来源是一个急需解决的问题.目的:探讨羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成.材料:羊水标本来自孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得60 mL羊水.方法:采用免疫磁珠细胞分选法去除人羊水细胞中CD44和SSEA-4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿间充质干细胞间接得到分离,并在体外进行培养扩增.取第3代羊水来源OCT-阳性胎儿间充质干细胞,诱导组换用含体积分数为15%胎牛血清的内皮细胞生长培养液,对照组持续用原培养液培养细胞.主要观察指标:倒置相差显微镜观察诱导过程中细胞形态变化,采用间接细胞免疫荧光法、内皮细胞吞噬Dil-acLDL法检测诱导效果.结果:诱导30 d后,镜下观察细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观,经诱导的羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞可在体外保持良好的增殖活力.诱导后的贴壁细胞eNOS和、vWF呈阳性表达,细胞胞浆内可见发出红色荧光的Dil阳性细胞;对照组细胞免疫荧光染色eNOS和vWF均呈阴性,且无红色荧光细胞出现.结论:羊水来源的OCT-4阳性的胎儿间充质干细胞在适当的体外微环境下,可诱导分化为血管内皮细胞.     

胚胎干细胞和间充质干细胞分化为内皮细胞的研究现状

内皮细胞对于维持血管正常功能具有重要作用,然而其来源有限.因此,寻找内皮细胞的其他丰富来源一直为研究者们所关注.干细胞在体外培养具有能大量增殖、并在合适的条件下定向分化的特性.近年来,各种类型的干细胞诱导分化为内皮细胞的研究不断深入并各有优缺点.对胚胎干细胞和各种来源的间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的研究现状作一综述.     

人羊水来源干细胞与生物可降解材料体内外复合培养构建组织工程膀胱平滑肌

目的 探讨体外高效地诱导人羊水来源干细胞向平滑肌样细胞的分化,评估细胞与聚羟基乙酸(PGA)支架复合物的生物相容性,由此探讨该复合物用于组织工程膀胱平滑肌重建的可行性.方法 孕中期B超引导下穿刺抽取羊水,体外分离挑选原代人羊水来源的干细胞(hAFCESs),取第三代细胞用肌源性生长因子(PDGF-BB)和转化生长因子β1(TGF-β1)和左旋维生素C(L-AA)在体外分别诱导分化3周、4周和5周,然后光镜下观察诱导后细胞生长的形态变化,免疫荧光细胞染色和RT-PCR检测平滑肌细胞的标志物.取第四代人羊水来源干细胞种植到非编织PGA材料上,体外诱导培养4周后移植到裸鼠背部皮下,4周后取材进行体内外种植效果的评价.结果 hAVESCs体外增殖能力强,RT-PCR、免疫荧光细胞染色显示经诱导的hAFCSCs表达平滑肌细胞的标志物平滑肌肌动蛋白(α-SMA),肌钙蛋白(CALP),平滑肌22α(SM22α)和肌球蛋白重链(MHC).PGA支架上的hAFCSCs在种植4 h后开始正常贴附、生长和增殖,细胞形态良好.扫描电镜显示hAFCSCs紧密贴附到PGA支架材料上并分泌细胞外基质.冰冻切片免疫荧光染色显示组织块中表达平滑肌细胞的标志物.结论 hAFCSCs能在肌源性生长因子(PDGF-BB和TGF-β1)和左旋维生素C(LAA)的诱导作用下高效地分化为平滑肌样细胞.复合hAFCSCs的PGA支架体外具有良好的生物相容性及体内较好的组织相容性,表明以hAFCSCs为种子细胞、PGA为支架构建组织工程膀胱平滑肌具有可行性.

Abstract：

Objective To investigate the potential of human amniotic fluid colony-derived stem cells (hAFCSCs) efficiently differentiating into smooth musle cells,and evaluate the biocompatibility of cell-PGA composite scaffolds and the fesibility of reconstraction of bladder smooth muscle tissue in vitro and in vivo . Methods hAFCSCs were obtained from second trimester amniotic fluid by ultrasound-guided amniocentesis performed on pregnant women. After expended in vitro, the 3rd generation hAFCSCs were induced in myogenic differentiation medium supplemented by myogenic growth factors (PDGF-BB and TGF-(31) and L-Ascorbic acid(L-AA) for 3 weeks,4 weeks and 5 weeks,and the differentiated cells were identified morphologically and the myogenic phenotype were detected by gross observation,RT-PCR and immunofluorescence staining. The 4th generation hAFCSCs cells were seeded onto polyglycolic acid (PGA) unwoven fiber scaffolds and cultured for 4 weeks in vitro in myogenic differentiation medium, then PGA-cell composite scaffolds and pure scaffolds were separately implanted into subcutaneous pockets of nude mice. After 4weeks of implantation, the specimens were harvested and examined. Results The hAFCSCs expended rapidly in vitro. After induction with myogenic growth factors and L-AA,RT-PCR and immunofluorescence staining demonstrated that a-smooth muscle actin(α-SMA), calpommCALP ) smooth muscle 22a (SM22α) and myosin heavy chain(MHC) were expressed. The adhesion and proliferation of hAFCSCs on PGA fiber scaffolds were observed after 4 h.. As polymer degradation degraded, the hAFCSCs kept proliferation and converged. Microscopic and scanning electron microscope (SEM) observations showed that hAFCSCs spreaded over the PGA fibers with secreted extracellular matrices filling the space among the fibers. . Conclusions hAFCSCs derived from second trimester amniotic fluid can be efficiently induced into smooth muscle cells by myogenic growth factors (PDGF-BB and TGF-β1) and L-AA in vitro. The PGA possesses good biocompatibility and histocompatibility with hAFCSCs in vitro and in vivo. This preliminary work indicates the feasibility to generate urinary bladder smooth muscle tissue with tissue engineering technique.     

人类高低位隐睾睾丸引带内肌肉组分的探究

目的探讨人类高位和低位隐睾患儿睾丸引带内肌肉组分与睾丸位置的关系。方法收集隐睾患儿术中废弃的睾丸引带,以麻醉下未降睾丸的位置位于内环口以上的腹腔型隐睾为高位组(n=11),已出内环口但未出外环口的腹股沟管型为低位组(n=62),分别进行组织切片染色观察其组织构成。结果 11例高位组患儿均未观察到引带内肌肉或肌肉样结构;62例低位组患儿中43例可观察到横纹肌结构,且排列较分散。人类高位隐睾引带组织HE染色主要表现为较致密的结缔组织,含较多成纤维细胞、少量小血管,未见横纹肌组织结构;低位隐睾引带HE染色,则表现为混合性组织,可见较疏松排列的成纤维细胞、少量血管和较多纤维,可观察到横纹肌。高位引带Masson染色可见其组织中结构较致密,含有大量胶原纤维成分和少量小血管;低位引带Masson染色可见疏松的胶原纤维成分、小血管、横纹肌结构。横纹肌特异性免疫荧光MY-32染色在高位组未观察到阳性信号,低位组中可见明显横纹肌结构。结论人类隐睾睾丸引带在高位与低位时其组织肌肉成分存在差异,高位隐睾睾丸引带未见肌肉成分,低位隐睾睾丸引带中存在横纹肌。     

可诱导表达BMP4的正常来源及隐睾特异性iPSCs的建立及分化研究

目的建立可诱导表达骨形态发生蛋白质4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的正常来源及隐睾特异性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),比较两者体外定向分化的差异,为研究部分隐睾患儿成年后不育的原因提供具有人类遗传背景的体外研究模型。方法①建立可诱导表达BMP4的正常来源及隐睾特异性iPSCs,将正常来源iPSCs作为对照组,隐睾特异性iPSCs作为隐睾组;利用多西环素(doxycycline,Dox)进行诱导,筛选出BMP4表达量最高的细胞株;②将外源性添加BMP4的正常来源iPSCs作为外源性添加BMP4组(外源组),将Dox内源诱导BMP4表达的正常来源iPSCs作为Dox内源诱导BMP4表达组(内源组),此两组共同作为实验组;在细胞形态和基因表达水平比较实验组两组间BMP4因子诱导效果的差异;③通过Dox诱导BMP4的表达、双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)、全反式维甲酸(all trans retinoid acid,ATRA)组成的三步法诱导分化方案,逐步诱导人的正常来源及隐睾特异性iPSCs向生精细胞方向分化,在基因及蛋白水平进行检测,比较两株细胞在分化过程中的差异。结果①经Dox诱导后,在正常来源及隐睾特异性iPSCs两株细胞中均可检测到BMP4表达明显升高、同时多能性基因OCT4的表达均呈明显下降趋势,与d0相比差异具有统计学意义,其中对照组的3#细胞株与隐睾组的5#细胞株在Dox诱导后BMP4表达量最高;②与外源组相比,内源组的细胞株形态变化更为均一、同步,BMP4的基因表达量更高,两组间的差异具有统计学意义;③在向生精细胞诱导分化过程中,对照组及隐睾组细胞的DAZL和PRDM1的表达量在两组之间的差异均无统计学意义;隐睾组的VASA、SYCP3、ACROSIN和TEKT1的表达量于诱导d14和d21时均明显低于对照组,两组之间的差异具有统计学意义。免疫染色结果显示:DAZL的阳性率在对照组和隐睾组细胞间的差异无统计学意义;隐睾组的VASA和SYCP3的阳性率于诱导d14和d21时均明显低于对照组,ACROSIN的阳性率于诱导d21时明显低于对照组,差异均具有统计学意义。结论本研究为部分隐睾患儿成年后不育的原因提供了具有人类遗传背景的体外研究模型,为未来的进一步研究奠定了良好基础。     

碱性成纤维细胞生长因子和Noggin诱导人羊水来源干细胞向神经细胞分化的差异比较***☆

背景：相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源。 目的：观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响。 方法：羊水标本来自怀孕16~22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得。利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定。选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组。倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达。 结果与结论：利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性。诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高。Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异。提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin。     

利用人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化模型建立体外神经毒性测试的实验研究

目的 许多药物具有神经毒性,尤其是对于儿童的影响更大.目前常用的药物体内毒性实验既耗时又昂贵.人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化有望建立一种理想的用于评价药物神经毒性的体外评估系统.此项研究旨在利用红藻氨酸的神经毒性验证此系统的可行性.方法 单层贴壁状态下,人胚胎干细胞和人羊水干细胞在化学成分明确的诱导条件下向神经细胞诱导.这些细胞经神经细胞特异性的抗体染色证实其特性.诱导得到的神经细胞在不同浓度红藻氨酸的培养液中进行培养和扩增,每代细胞进行计数,绘制细胞的生长曲线.结果 人胚胎干细胞和人羊水干细胞均可被高效地诱导为神经细胞;人胚胎干细胞的神经诱导效率高于人羊水干细胞;红藻氨酸对诱导得到的神经细胞具有毒性,其浓度与毒性呈正相关.结论 人胚胎干细胞和人羊水干细胞的体外神经分化可作为用于评价药物神经毒性的体外评估系统.

Abstract：

Objective A lot of drugs have side effects on the central nerves system. Especially in children. In vivo neurotoxicity tests are time-consuming and expensive. The neural differentiation of human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells provides all ideal in vitro system that Can be applied to evaluate neurotoxicity of drugs. This study was to try to establish such a system. The kainie acid was selected to test the neurotoxicity. Methods The human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells were indueed to differentiate into neural cells by a chemically defined neural induction medium. The induced neural cells were propagated in the presence of basic fibroblast growth factor. Immunocytochemical staining Was applied to confirm these cells' neural identity. The induced cells were propagated under different concentration of kainic acid, then the gosh curve were made based on the cell numbers. Results Both of the human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells could be efficiently induced to be differentiated into neural cells. The neural differentiation efficiency of human embryonic stem cells is higher than that of human amniotic fluid stem cells. The kainic acid has neurotoxieity to the indueed neural cells. Conclusions The neural differentiation of human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells were proved to provide a rapid and convenient approach for estimating the neurotoxlcity of drugs.     

人胚胎干细胞饲养层培养体系的研究进展

人胚胎干细胞(hES细胞)来源于着床前人囊胚内细胞团(ICM),由于具有体外无限增殖和分化成3个胚层来源的各种细胞的潜能,使其成为当今生命科学的研究热点.建立一个理想的hES细胞培养体系是利用它的前提.目前,最常用的hES细胞的体外培养方式是将其培养在饲养层细胞上.迄今为止,已经有多种细胞用于hES细胞的体外培养.饲养...