变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸操纵子的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸操纵子(kgu操纵子),明确其基因组成及生物学信息。根据报道的假单胞菌的基因组信息设计简并引物,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的kgu操纵子,对克隆的基因片段进行测序,在此基础上利用生物信息学方法进行分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为6 130bp,其中包括基因ptx S、kgu E、kgu K、kgu T和kgu D,分别编码2-酮基葡萄糖酸代谢调控蛋白Ptx S、2-酮基葡萄糖酸差向异构酶、2-酮基葡萄糖酸激酶、2-酮基葡萄糖酸转运蛋白和2-酮基葡萄糖酸-6-磷酸还原酶;这些基因与铜绿假单胞菌PAO1的kgu操纵子中相应基因的序列一致性达56.15%~76.74%,然而变形假单胞菌的ptx S很可能并不位于kgu操纵子中。研究首次从变形假单胞菌中克隆到kgu操纵子,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸代谢机理的研究奠定了基础。     

荧光假单胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸

研发荧光假单胞菌JD1202转化大米淀粉水解糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的连续发酵工艺.考察了连续发酵起点、稀释率和补料培养基中葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸生产的影响.结果表明,稀释率和葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵具有显著影响;在稀释率和补料培养基成分保持不变的条件下,2-酮基-D-葡萄糖酸大量合成期的任何时段均可作为连续发酵的起点,其细胞浓度、残糖浓度和2-酮基-D-葡萄糖酸浓度均稳定在一定范围.较适的连续发酵操作条件为:稀释率0.065h-1,补料培养基中葡萄糖的质量浓度为170.0g/L.在此条件下,连续发酵达到稳态时发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度为130.34g/L,生产强度平均为8.47g/L·h,发酵转化率为89.46％.连续发酵工艺是一种高效的2-酮基-D-葡萄糖酸生产方法,有望应用于工业生产中.     

镉超标大米水解糖发酵生产2-酮基葡萄糖酸过程中镉的迁移规律

目的 揭示以镉超标大米为原料发酵生产2-酮基葡萄糖酸过程中镉的迁移规律,并获得符合食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠合成要求的2-酮基葡萄糖酸。方法 以正常大米、镉超标大米和混合大米为原料,系统分析大米糖化、种子培养、2-酮基葡萄糖酸发酵、发酵产物提取等过程中镉的含量和分布,确定镉的迁移规律及其对2-酮基葡萄糖酸发酵性能和D-异抗坏血酸钠产品品质的影响。结果 大米原料和辅料碳酸钙中的镉的含量对2-酮基葡萄糖酸发酵性能影响不显著;发酵产物的提取过程有效降低了2-酮基葡萄糖酸中的镉含量,提取过程中产生的酸化废渣（主要由硫酸钙和菌体组成）可富集90%以上的镉;以镉超标大米为原料制备的D-异抗坏血酸钠的质量符合国家标准要求,未检出镉的存在。结论 该研究为综合利用镉超标大米生产2-酮基葡萄糖酸、进而生产高附加值的食品添加剂D-异抗坏血酸钠提供了理论依据和技术支撑。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

采用降落聚合酶链式反应（touchdown polymerase chain reaction,TD-PCR）技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kguE。将目的基因与质粒pET-28a（＋）重组后转入宿主表达菌中,获得了重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5?ku的融合蛋白,且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由256?个氨基酸残基组成的分子质量为28.5?ku的亲水性蛋白,与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%,定位于细胞质中,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。     

补料分批培养生产2-酮基-D-葡萄糖酸的研究

研究了补糖对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4生产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响,并在50kL发酵罐上进行了补料分批培养工业应用性试验。研究结果表明,采用补料分批培养方法,能有效提高发酵液中的产物浓度;开始补糖时发酵液中的残糖浓度以3%～6%为宜;补料分批培养方法及AR4菌株可用于2-酮基-D-葡萄糖酸的工业化规模生产中。     

变形假单胞菌吡咯喹啉醌合成基因簇的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆到吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇,阐明了其基因组成和生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组进行简并引物设计,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的PQQ合成基因簇,对克隆的基因片段进行测序并使用生物信息学方法进行综合分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为11 659 bp,其中包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH和pqqI共9个基因,编码PQQ生物合成的前体短肽PqqA和合成途径的相关酶;这些基因与荧光假单胞菌Pf0-1的PQQ合成基因簇的基因组成类似,相应基因的序列一致性达41%～94%。本研究中首次从变形假单胞菌中克隆到PQQ合成基因簇,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌的PQQ生物合成途径和胞内再生机制的研究奠定了基础,进而为提高2KGA的生产强度提供了理论支撑。     

工业生产条件下噬菌体对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响

考察了工业生产条件下噬菌体对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的危害，并研究了噬菌体侵染后菌体形态、种子培养过程和发酵过程的变化。研究结果表明，噬菌体侵染导致了发酵转化率的下降、发酵周期的延长和发酵液过滤速率的降低。发酵前期、中期和后期的噬菌体侵染所造成的危害差异显著（p〈0．01），侵染时期愈早所造成的危害愈大。     

枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株C1-B941菌种特性的初步研究

C1—B941是一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的转酮醇酶(Transketolase，TKT)变异株，与亲株C1相比，其在菌体形态及代谢特性上发生了显著变化，如对戊糖不利用，对葡萄糖等利用变弱，碳源利用存在抑制，表现为芳香氨基酸合成途径缺陷，对数期细胞聚集成链，孢子形成能力下降，在发酵培养基中可以积累D-核糖，发酵液具有广泛的用途。