1，3-丙二醇脱氢酶一步纯化与杂化凝胶固定化的初步研究

转录表达来源于Klebsiella．pl,3-丙二醇脱氢酶（PDH）基因片段的E．coli工程菌,在5L发酵罐、30℃、pH值7．0、200r／min（微氧）条件下培养20h;发酵菌体经破碎分离后所得样品通过HisTrap HP柱亲和层析一步纯化得到电泳纯的PDH,纯化倍数为2．94倍,活性回收率为50％,经SDS-PAGE电泳鉴定获得一条清晰条带,表达蛋白亚基相对分子质量约为41kDa。用改进的溶胶-凝胶法（杂化凝胶）包埋纯化酶,考察正硅酸乙酯（TEOS）浓度、海藻酸盐（ALG）浓度、CaCl2浓度及ALG与TEOS体积比等因素对酶固定化效果的影响,结果表明,较优包埋条件为：ρ（TEOS）=20g／L,ρ（ALG）=30g／L,ρ（CaCl2）40g／L,V（ALG）：V（TEOS）=3：1;由此制备的PDH的ALG-SiO2杂化凝胶保藏60天后酶活仍保持80％,进行批次反应时,反应3批后酶活保持70．3％,反应第6批时酶活剩余29.8％。     

源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成与抑制机理

探讨源于马铃薯多酚氧化酶(PPO)的酶活性中心必需基团组成与抑制剂对PPO的抑制作用类型。应用具有相对专一性的氨基酸基团化学修饰剂溴乙酸(BrAC)、乙酰丙酮(Hacac)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、1,4-二硫代苏糖醇(DTT)与对氯汞苯甲酸(pCMB)等对PPO进行化学修饰反应,确定源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成为组氨酸(His)的咪唑基、精氨酸(Arg)的胍基与色氨酸(Trp)残基,二硫键对酶活性中心的稳定有贡献作用但游离的硫基不是酶反应所必需的基团。抑制动力学实验表明乙醇对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.12 mmol/L,抑制类型为竞争性可逆抑制,苯甲酸对PPO的IC50为0.07 mmol/L,抑制类型为非竞争性可逆抑制。说明乙醇通过与PPO酶活中心结合抑制PPO酶活性而苯甲酸则通过与PPO非酶活中心的结合抑制PPO酶活。     

膜反应器中辅酶再生体系的构建与研究进展

在膜反应器中基于膜介质支持构建辅酶再生的酶催化体系并实现酶促反应的连续进行是辅酶依赖型生物酶工业化应用的一个有效技术手段。本文总结了辅酶再生的意义与辅酶再生体系在膜反应器中的构建情况,并提出了在这过程中所需注意的问题及解决思路。     

植酸酶的激光诱变改性与分离纯化

植酸酶产生菌———黑曲霉(Aspergillus niger)可在不同的辐照条件下进行激光诱变,确定了适宜的诱变条件,即输出波长为1.06μm的Nd:YAG高重复率声光调Q激光,辐照频率4 kHz,功率10 W,水平照射2~2.5m in,并建立了变异菌株基因库。通过高通量筛选,从中筛选到一株酶学性质比较符合工业生产要求的变异菌株phy226,pH=2~3的第二酶活峰提高了40%,酶活温度稳定在30~60℃。发酵液经盐析、透析、凝胶层析和离子交换层析等分离纯化过程,最终纯化倍数达7.8,收率为25.2%。     

几种植酸酶活测定方法的修正与差异比较

对目前文献所见到的植酸酶活的测定方法选取三种进行了分析和修正,并用两种温度下的酶活定义检验修正过的测定方法的差异。根据显色剂吸收光谱和磷化合物的吸收光谱的比较,确定FeSO_4—钼蓝法选取大于720nm、VC—钼蓝法选取620～660nm、丙酮法选取400～420nm的波长为测量适宜波长。在同样温度下(即对一种酶活定义来说,)用这三种方法测定曲霉发酵液的植酸酶活,结果酶活大小基本一致(平均差率小于5％),说明这三种方法在测定植酸酶活时都有相等的可靠性和准确性。     

一种可控制生物微胶囊尺寸的气流微囊发生器

控制胶珠或胶囊的尺寸是生物微胶囊在人工器官和细胞固定化应用方面的要求.建立了一种通过气流作用于针头出口处的液滴,来制备比较均一的、可控尺寸微胶囊的方法.通过对针尖出口处液滴的受力分析,建立了描述液滴尺寸和气体出口处流速之间关系的方程.通过该方程可以根据对胶珠(或胶囊)尺寸的需要,计算得到应该实际控制的气流速度.最后通过Alginate/Ca凝胶珠和NaCS/PDMDAAC微胶囊两种体系,在不同气流速度下获得的胶珠和胶囊尺寸,对建立的方程进行了实验验证,并同时对制得的胶珠和胶囊的尺寸分布进行了表征.实验结果表明,通过气流法可在1.0mm~2.6mm范围内获得尺寸较均一的胶囊和胶珠.     

耦合透性化辅酶循环制备手性(R)-苯基乙醇

通过耦合透性化博伊丁假丝酵母(Candida boidinii,C.boidinii)加强了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis,C.parapsilosis)内羰基还原酶(Carbonyl reductase,CR)催化反应中的辅酶循环与反复利用,构建了有效的手性(R)-苯基乙醇透性化细胞耦合制备体系。实验结果如下:透性化的C.parapsilosis细胞底产物渗透效果增强,底物转化率由33.5%提升到43.8%;进一步外添加辅酶后,底物转化率由43.8%提高到了52.1%;耦合透性化C.boidinii细胞并同时外添加辅酶可大大增强辅酶循环效率,底物转化率可提高至71.8%。优化透性化细胞耦合体系反应条件,当以0.2 g近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)为基准时,在C.parapsilosis与C.boidinii细胞质量比为1.5∶1,底物浓度为10 mmol/L,辅酶浓度为0.1 mmol/L时,底物转化率可达78.2%。离心法收集细胞进行多批次反应,当反应12批次时,耦合体系仍然保持有55%底物转化率,此时总的底物转化率达70.3%,产物经高效液相色谱测定为(R)-苯基乙醇,对映体过量值(e.e.值)达98.2%。     

纳米粒子固定化双酶耦合体系连续催化制备(R)-苯基乙二醇

将活化醇盐水解法制备的SiO2纳米粒子分别与羰基还原酶(CR)和甲酸脱氢酶(FDH)进行共价固定化,固定化CR与FDH耦合,连续催化转化b-羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇,考察了NADH的再生与循环利用性. 结果表明,纳米粒子固定化CR和FDH酶载量分别为3.32和5.55 mg/g,催化活性为游离酶的50%~60%,最适反应pH值分别为6.5和8.5,最适反应温度分别为40和45℃. 耦合体系进行12批次反应,产物(R)-苯基乙二醇累积量达35.6 g/L,纳米粒子生产能力达178 g/g. 纳米粒子固定化酶经简单离心收集后可重复利用.     

工程菌发酵产酶及其在1,3-丙二醇耦合酶催化制备中的应用

培养定向进化后的质粒保藏菌E.coli BL21(DE3)pLysS/PET-15b-dhaT’-24并进行质粒抽提,将抽提的质粒转化入感受态宿主细胞E.coli BL21(DE3)pLysS中得产1,3-丙二醇氧化还原酶的工程菌。工程菌经乳糖诱导后进行发酵培养获得酶活为182 U/mL的1,3-丙二醇氧化还原酶,最适反应pH值为10,pH值稳定范围为7.0～9.0,最适反应温度为55℃,温度稳定范围为30～45℃。利用工程菌产的1,3-丙二醇氧化还原酶进行转化3-羟基丙醛为1,3-丙二醇的反应,同时偶联甘油脱氢酶(由另一工程菌制备)转化甘油的反应进行辅酶NADH的再生,实现了1,3-丙二醇的双酶耦合的连续反应。由于来源于工程菌的双酶酶学性质相适应,反应连续进行34 h后,底物3-羟基丙醛的转化率达63.4%,产物1,3-丙二醇的产率达64.6%。     

3-羟基丙醛耐受菌的筛选与3-羟基丙醛抑菌活力的研究

活化的短乳杆菌用含一定甘油浓度(10 g/L)的平板培养基驯化培养后铺上一层含活化E.coli的培养基,30℃双层平板培养,经7个批次筛选,获得了1株在其周围产生明显抑菌透明圈的短乳杆菌菌落,编号为LB7—6;纯化培养筛选出的短乳杆菌,分别在30℃、37℃下进行二次发酵2～8 h,测定发酵液中3-羟基丙醛(3- HPA)的含量。结果显示,较优化发酵条件为37℃微氧静置发酵6h,在此条件下,3-HPA含量为2.18mg/mL,由此计算得3-HPA总得率为0.147g/g,转化率为19.05%;以10~5个/mL E coil为检测菌,采用比浊法实验,结果表明,发酵所得3-HPA最小抑菌浓度(MIC)为2.18×10~(-3)mg/mL;发酵液40℃保存48 h后测定3—HPA的MIC为2.18×10~0mg/mL,说明所产3-HPA抑菌活力有一定程度的稳定性。