5种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立

目的建立肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒基因组序列,分别设计肠道病毒5′UTR基因、乙型脑炎病毒E基因、麻疹病毒M基因、风疹病毒E基因和腮腺炎病毒M基因的特异性引物,建立多重RT-PCR检测方法,并进行敏感性验证。结果应用5种引物可分别扩增脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的152、429、111、352和274 bp特异基因条带。对脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的的敏感度分别为62.5 CCID50/ml、250 PFU/ml、125 CCID50/ml、125 CCID50/ml和125 CCID50/ml。结论初步建立了5种脑炎RNA病毒多重RT-PCR检测方法,该法敏感性良好,可用于5种脑炎相关RNA病毒的快速检测。     

表达人胰岛素的人参愈伤组织细胞系的建立

目的建立表达人胰岛素的人参愈伤组织细胞系。方法将已构建成的植物表达载体pBI121/(CTB-BA)转入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌与人参愈伤组织细胞的共培养,将人胰岛素基因整合到人参愈伤组织细胞中,对其表达产物进行检测,并用小鼠进行降糖试验。结果表达产物的基因组DNA测序结果与设计完全相同。Westernblot检测显示,在相对分子质量约17000处有特异蛋白反应带。ELISA法检测人胰岛素表达量为5.31μIU/ml。小鼠降糖试验表明人参愈伤组织细胞有降血糖的作用,而转化的人参愈伤组织细胞降血糖作用更明显。结论人胰岛素已在人参愈伤组织细胞中成功表达。     

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。     

植物细胞表达人胰岛素的载体构建

目的构建人胰岛素的植物细胞表达载体。方法设计多对引物,通过PCR反应合成霍乱毒素B亚单位(CTB)基因和不带C肽的人胰岛素基因。将霍乱毒素B亚单位(CTB)基因与这种不带C肽的人胰岛素基因融合后,插入克隆载体,然后用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切,并将酶切的融合基因片段连接在植物表达载体pBI121上,最后用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切鉴定。结果测序结果表明,PCR扩增的目的基因顺序与设计完全一致,并构建了克隆载体和植物表达载体。植物表达载体经酶切后鉴定,所含基因片段大小与预期相符。结论已成功地构建了人胰岛素基因的植物细胞表达载体。