从cDNA文库中筛选分析阳性克隆的简便方法

cDNA文库中阳性克隆的传统筛选分析法既费时又费力.利用微波炉加热的方法,简化了原位杂交中噬菌斑裂解、DNA变性与固定的程序;进一步运用PCR扩增技术,特异扩增克隆载体中插入的cDNA片段,加快了阳性克隆分析的进程.     

豌豆外源凝集素基因的克隆及序列分析

从豌豆幼叶分离基因组ＤＮＡ,设计特异引物,用聚合酶链式反应方法扩增出豌豆外源凝集素基因并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＥｃｏＲＶ位点。进一步亚克隆至ｐＵＣ１９。序列分析表明,克隆到的片段大小为８３２ｂｐ,包含了豌豆外源凝集素基因完整的编码序列。该基因无内含子,同报道的已知序列相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为９９．６％和９８．９％。     

中国人群1、9、16和Y染色体C带多态性的研究——汉族和黎族人群的比较

应用C带技术,研究了汉族56人和海南岛黎族19人1、9、16、Y染色体中结构异染色质的多态性。汉黎两族1、9、16和Y染色体的C带正常类型分为3、2、2、3类。1、9、16、Y染色体C带大小及位置改变的变体发生频率,两个民族基本一致,无显著性差异。性别间比较,也无显著差异。汉黎两族共75人,染色体C带变体总数为115个,其中1号染色体51个,9号34个,16号7个,Y13个;1号染色体部分倒位5个,9号部分倒位5个。两族1、9、16号同源染色体C带多态分布的频率符合Hardy-Weinberg定律。     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法。通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm。载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA。利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59．2％。对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19．5％的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ。这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物。研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20．0％～47．4％,低于使用双T-DNA转化的共转化频率。     

烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

水稻cDNA文库的构建及巯基蛋白酶抑制剂cDNA的分离

取开花后2周左右的水稻未成熟种子提取总RNA,分离mRNA,进而反转录合成cDNA并定向插入λgt22A克隆载体,经体外包装建成水稻未成熟种子的表达型 cDNA文库,经测定库容量达 1.5 × 10⁶ Pfu.进一步人工合成水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin)编码基因5＇-端保守的21Nt的寡核苷酸经末端标记作为探针,从 2.1×10⁴Pfu中筛选出 9个阳性克隆,经鉴定其中 8个含有完整的水稻巯基蛋白酶抑制剂编码序列,对 1号克隆的序列分析表明,其除含有 309 bp的水稻巯基蛋白酶抑制剂编码序列外,在 5＇-端及 3＇-端还分别含有 84 bp和 497 bp的非编码序列,其中 3＇-端带有AATAAAA两个加尾信号以及31 Nt的Poly(A)尾,同水稻巯基蛋白酶抑制剂基因组序列比较,编码区碱基序列完全一致,但5＇-端和3＇-端非编码区有明显差异,其中加尾信号以后的cDNA碱基序列中含有大量的不连续插入.     

高效Bt抗虫基因表达结构的构建及其在转基因烟草中表达行为的研究

构建了高效植物表达载体pBinMoBc,其携带有超强表达复合启动子OM及Ω因子控制下的CryIA?基因,作为对照,本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的CryIA?基因的植物表达载体pBinoBc。分别使用两个植物表达载体转化烟草,ELISA检测表明,在pBinMoBc转基因烟草中CryIA?基因的平均表达水平是pBinoBc的2.44倍,最高可达可溶蛋白的0.255%。抗虫检测结果表明,pBinMoBc转基因烟草与pBinoBc转基因烟草相比,具有更强的抗棉铃虫效果。上述结果表明,OM启动子比CaMV 35S启动子更具有实际应用价值,此结果在植物抗虫基因工程研究中具有重要意义。     

转化脂介导小麦原生质体转化及转基因白化苗的再生

应用转化脂(Lipofectin)介导转化技术成功地将含有潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphotransferase,Hpt)基因的E．Coli质粒pCGNl055导入到了小麦(徐州211)原生质体内,并由此获得了转化愈伤组织。根据Hpt抗性及DNA分子杂交证实转化频率高达6．O－8．8％,在分化培养基上转化愈伤组织再生出了白化植株,通过Southern杂交和酶活性检测证明外源Hpt基因存在于转化植株(白化苗)内,并进行了有效的表达。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用

大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有抗虫特性。从未成熟的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）子叶中提取总ＲＮＡ,然后反转录成单链ｃＤＮＡ,以此为模板,用ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因,并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）的ＳｍａⅠ位点上。序列分析表明：克隆片段大小为６６３ｂｐ,包含了基因完整的编码序列。编码多肽由２１７个氨基酸组成,其中包括Ｎ端２５个氨基酸组成的信号肽序列,１８１个氨基酸组成的成熟蛋白序列和Ｃ端１１个氨基酸组成的液泡定位信号序列。构建了此基因的一系列植物表达载体,用于烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）等作物的转化。利用棉铃虫（ＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ）对经ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交验证获得的转基因烟草进行了抗虫测试,结果表明,转基因烟草和对照烟草相比,具有明显的抗虫能力。