中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

通过同源介导α-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一.为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL.将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株Bacillus licheniformis B0204,再在卡那霉素存在下介导其B.1icheniformis B0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子.对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定.与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高.其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%.     

通过同源介导a-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌a-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL。将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株BacilluslicheniformisB0204,再在卡那霉素存在下介导其B.licheniformisB0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子。对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高。其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%。     

基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法

快速、高效删除大肠杆菌染色体DNA的目的基因是大肠杆菌代谢工程研究的前提和基础。利用Red重组系统结合Xer重组系统删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的ackA-pta基因和pps基因。实验证明了可重复应用dif位点实现大肠杆菌染色体上多基因突变的叠加,同时,在染色体上并未留下抗生素标记,借此能够高效地实现多基因缺失突变株的构建。此外,本方法重组效率高,实验步骤较简便。     

高速逆流色谱法分离制备花生壳中的黄酮类化合物

应用高速逆流色谱法首次从花生壳中分离制备了3种黄酮类化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸(5:3:3.5:5:0.25,v/v)为两相溶剂系统,在主机转速800 r/min、流速2 mL/min、检测波长275 nm条件下进行分离制备,纯度用HPLC法测定,各化合物结构经质谱和核磁共振氢谱、碳谱鉴定。结果表明,100 min内从70 mg花生壳粗提物中一步分离制备得到木犀草素11.0 mg,香叶木素2.2 mg,5,7-二羟基色原酮5.2 mg,其纯度均达96.0%以上。利用该方法可以对花生壳中的黄酮类化合物进行快速的分离和纯化。     

AMYF生化特性的人工进化——突变库筛选体系研究

通过随机突变策略建立了耐高温α-淀粉酶(AMYF)的突变库,为了筛选有益的突变体建立了一种快速的基于微量滴定板上的胞内α-淀粉酶的筛选体系。为了增加胞内酶活的可比性确定了比酶活(U/ml)筛选参数(1-A660/A660pET)/A600。对此法的可靠性进行了实验分析,并得到比酶活提高50%的突变体。为了筛选此酶最适pH降低的突变体,建立了最适pH变化的筛选方法。     

改善大肠杆菌胞内氨基酰tRNA池提高外源基因表达水平

大肠杆菌是研究和高效表达异源蛋白的常用宿主细胞。由于大肠杆菌和真核生物及大部分古细菌在同义密码子上的使用有很大的差异,来源于真核或古细菌的外源基因在大肠杆菌中表达时,常常由于其带有稀有密码子而带来翻译方面的问题,如产生移码突变和表达量下降等,从而改变异源蛋白的表达质量和表达水平。在研究常见嗜热菌tRNA结构和组成的基础上,以古细菌α淀粉酶基因为例,采用增加有argU、ileY和leuWtRNA基因的大肠杆菌DE3为表达宿主,改善了胞内氨基酰tRNA池的大肠杆菌表达异源蛋白,表达量提高约9倍。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定

根据已知α-淀粉酶编码基因保守区核苷酸序列,通过PCR和反向PCR技术克隆出Bacillus licheniformisCICIM B0204α-淀粉酶编码基因amyL全长序列及其上下游序列。B.licheniformisCICIM B0204amyL由1539bp组成,其上游180bp为启动子序列,下游160bp为终止子序列;成熟肽由512个氨基酸残基组成,氨基端的29个氨基酸残基为α-淀粉酶的信号肽。通过基因及其氨基酸序列比对发现,amyL及其编码产物与芽孢杆菌来源的α-淀粉酶具有高度相似性。将amyL的结构基因在PT7介导下于大肠杆菌中诱导表达,获得具有α-淀粉酶活性的表达产物。将amyL的启动子序列和信号肽序列与B.licheniformisCICIM B2004的β-甘露聚糖酶结构基因进行读框内重组,在大肠杆菌中获得了β-甘露聚糖酶的分泌表达,重组大肠杆菌表达295U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。     

石油降解菌X-1所产表面活性剂的研究

对石油污染土壤中筛选到的能产生生物表面活性剂的石油降解菌X-1(芽孢杆菌),进行表面活性剂的提取和鉴定,并对其产剂条件进行了优化。结果表明:菌株X-1产生的生物表面活性剂为浅黄色粉末状物质。通过硅胶板薄层层析和红外光谱分析,判定表面活性剂为脂肽、脂蛋白类物质。菌株X-1产生表面活性剂的最佳条件为:温度32℃,pH 7.0,盐度2 g/L NaCl,最佳碳源为淀粉,最佳氮源为蛋白胨。     

嗜热菌来源的生淀粉酶分离纯化及其酶学性质

从嗜热菌库中分离到两株能水解生淀粉的菌株173和174,通过扩增和测定两株菌的16S rDNA序列并进行比对结果表明,所分离两株菌属于Geobacillus属的细菌.液体摇瓶发酵菌株173、174,其产生的生淀粉酶(简称RSDE173、RSDE174)活力分别达14.5 U/mL和12.9 U/mL.通过生淀粉吸附-熟淀粉洗脱系统和TOYOPEARL HW-55F系统进行分离纯化,得到纯化的RSDE173和RSDE174,纯化倍数分别为50和29,活力回收率分别为34%和41%.有关RSDE173和RSDE174酶学性质研究显示.对熟淀粉水解的最适作用温度均为70℃,而对生淀粉水解则分别在50℃～60℃和40℃～60℃下表现出高水解活力;对不同底物的最适作用pH值均为5.0～5.5;它们对大多数试验离子的敏感性较低,但个别离子如Co2 、Cu'2 对RSDE173或u'2 对RSDE174的酶活力有一定的抑制作用.纯化的这两种生淀粉酶对不同来源生淀粉的底物专一性并不相同.RSDE173底物专一性顺序为红薯淀粉>小麦淀粉>玉米淀粉>木薯淀粉>糯米淀粉;而RSDE174的糯米淀粉>小麦淀粉>红薯淀粉>玉米淀粉>木薯淀粉.RSDE173对生红薯淀粉有很好的降解,其水解糊化淀粉与生红薯淀粉的比值为1.48;而RSDE174优先降解生糯米淀粉,其相应比值为1.69.