尼古丁受体CHRNA5 亚基突变对其功能影响的初步研究

摘要 目的：研究CHRNA5亚基突变对尼古丁受体功能的影响。方法：通过RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,并通过重叠延伸PCR方法对CHRNA5亚基基因定点突变,从而构建CHRNA5突变型及野生型表达载体,然后转染至HEK293T细胞中,检测其基因表达。并将其分别与CHRNA3和CHRNB4共转至HEK293T细胞中,检测三质粒共转后的基因表达;通过采用尼古丁持续灌流细胞10 min,然后检测细胞内钙离子内流峰值的变化情况,接下来检测突变对转染后细胞活力的影响。结果：构建的CHRNA5表达载体在转染HEK293T细胞48 h后,能够检测到绿色荧光蛋白的表达,这证明重组载体已成功转染进HEK293T细胞;通过RT-PCR检测出转染细胞CHRNA5 mRNA表达,这证明CHRNA5突变型和野生型均在HEK293T细胞中成功进行了表达。通过尼古丁灌流细胞实验显示突变组和野生型组F340/F380峰值变化均值分别为0.865±0.048和0.447±0.127,突变体组峰值显著高于野生型组（P<0.05）。细胞活力检测实验发现0.01 mM和0.1 mM尼古丁刺激下突变组的细胞活力峰值分别为139%和137%,显著高于野生组的124%和126%,有显著差异（P<0.05）。结论：本研究成功构建了CHRNA5突变及野生型真核表达载体,发现CHRNA5的突变会导致其受体功能性改变,并影响细胞活力。     

醋酸铅对体外培养大鼠肾小管上皮细胞的毒性损伤

探讨醋酸铅对体外培养的大鼠肾小管上皮细胞系HBZY-1的细胞毒性效应.用不同浓度的醋酸铅(30、40、50 μmol/L)作用HBZY-1细胞24 h、48 h和72 h,采用CellTiter-Glo(R)萤光细胞活性检测盒测定细胞存活情况;用流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果显示经30、40、50μmol/L醋酸铅处理...     

清肺化痰汤灌胃治疗对急性胰腺炎大鼠相关肺损伤的作用

摘要 目的：探讨清肺化痰汤灌胃治疗对急性胰腺炎大鼠相关肺损伤的作用。方法：45只SD大鼠随机分为3 组-正常对照组(15只)、模型组(15只)、清肺化痰组(15只),模型组与清肺化痰组都建立了急性胰腺炎大鼠相关肺损伤模型,对照组仅开腹后轻翻胰腺组织后缝合。清肺化痰组在造模前2 h给予清肺化痰汤0.6 mL/100 g灌胃,对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃。结果：模型组与清肺化痰组建模后24 h、36 h、48 h的血清淀粉酶、IL-6、IL-8水平都高于对照组(P<0.05),清肺化痰组低于模型组(P<0.05)。模型组与清肺化痰组建模后24 h、36 h、48 h的肺组织病理评分、Caspase-3蛋白相对表达水平高于对照组(P<0.05),清肺化痰组低于模型组(P<0.05)。结论：清肺化痰汤灌胃治疗急性胰腺炎大鼠相关肺损伤能调节肺脏细胞凋亡水平,抑制炎症因子的释放,从而减轻肺损伤,改善大鼠的病情。     

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸 半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox（-3 853～ -3 848）的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（L2）,比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2（differentiated embryo chondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2）真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）和超级迁移率实验（supershift assay）检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响. 结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(－3 853～－3 848）与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western 印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox（－3 853～－3 848）有关.     

GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达

研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征．分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体．转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验（EMSA）和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用．结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件（-1 090～-1 085）和双缺失AHR/ARNT元件（-1 090～-1 085,-215～-210）的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达（均P＜0.05）,而缺失AHR/ARNT元件（-215～-210）则未见显著影响（P＞0.05）; 独立AHR/ARNT元件（-1 090～-1 085）具有转录促进作用（P＜0.05）而独立AHR/ARNT元件（-215～-210）无明显影响（P＞0.05）．转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达（P＜0.05）．EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT．因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件（-1 090～-1 085）是GCLC基因中重要的抑制元件．     

稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立

目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。