用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因

mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 .     

小鼠胚胎体外发育培养基中氨基酸含量变化

通过检测哺乳动物早期胚胎体外发育过程中可以消耗或生成某些氨基酸的含量,可以了解胚胎的发育潜能。利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测KSOMaa培养基中17种氨基酸含量的变化,了解昆明小白鼠(Mus musculus)植入前胚胎体外培养过程中氨基酸含量的变化,旨在寻找一种能有效支持昆明小鼠胚胎体外发育的培养基氨基酸组成,优化小鼠胚胎体外培养体系。将180枚原核胚分为9组,体外培养至囊胚,分别于胚胎发育不同时期取样做高效液相色谱分析。这些氨基酸在胚胎发育不同时期的培养基中含量变化可分为5种类型:①在2细胞期增加但在4细胞期、8～16细胞期减少,囊胚期又增加的氨基酸(甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸);②在胚胎发育各个时期均下降(谷氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸);③在胚胎发育各个时期均增加(丝氨酸、赖氨酸、丙氨酸);④2细胞期含量减少而在其他时期持续增加(天冬氨酸、脯氨酸、色氨酸);⑤囊胚期减少,其他时期都有增加(异亮氨酸)。     

未成熟卵母细胞的形态与成熟能力、染色质构型和H3K27三甲基化水平的相关性研究

该文研究未成熟卵母细胞的形态指标与成熟能力、染色质构型和表观遗传模式的相关性,为家畜繁育和人医辅助生殖选卵标准提供参考。以经不同激素处理(N组、P组、H组)的小鼠未成熟卵母细胞作为实验材料,利用滴中孔技术进行体外跟踪培养检测不同形态未成熟卵母细胞的成熟能力,Hoechst33342标记DNA AT双键研究染色质构型,H3K27三甲基化抗体检测全基因组H3K27三甲基化水平差异。结果表明,H组小鼠卵母细胞中,细胞质直径较小的更适合在滴中孔系统内培养成熟[(71.63±1.02)μm,A形态vs(68.33±0.97)μm,B形态,P0.05],核仁直径和透明带厚度与卵母细胞成熟能力无关。A形态卵母细胞NSN型(non-surround nucleolus)比例高于SN型(surround nucleolus)(78.57%vs 21.43%),B形态卵母细胞SN构型比例高于NSN构型(65.12%vs34.88%)。N、P、H三组小鼠卵母细胞H3K27三甲基化水平差异不显著,但N组小鼠中,A形态未成熟卵母细胞H3K27三甲基化水平显著低于B形态组(P0.05)。P组和H组小鼠中,A形态卵母细胞与B形态卵母细胞H3K27三甲基化水平差异不显著。如果不考虑激素处理分组,则A形态卵母细胞H3K27三甲基化水平显著低于B形态卵母细胞H3K27三甲基化水平(P0.05)。综上可知,卵母细胞形态可以反映其成熟能力、染色质构型和H3K27三甲基化水平,激素处理影响H3K27三甲基化水平。     

兔植入前移核胚中发育相关基因的差异表达分析

与早期胚胎发育相关的一些重要基因异常表达致使克隆胚细胞核的再程序化过程受阻,是导致动物克隆失败的重要原因.为了分离鉴定再程序化相关基因,我们改进了mRNA差异显示技术,成功地建立了单胚差示技术体系.以不同发育时期的兔克隆胚（MⅡ卵、2细胞、4细胞、8～16细胞克隆胚胎）为材料进行单胚差示, 分离了80个差异片段.经反向RNA印迹验证、亚克隆、序列分析及NCBI GenBank数据库检索, 结果表明：A028片段与CstF3基因有93％的同源性, 在早期胚胎发育过程中的表达有阶段特异性, 该基因在兔克隆胚的早期发育过程中起重要作用.RNA印迹显示：该基因在所检测的组织中,只在卵巢中有表达.这项研究为再程序化相关基因全长的克隆及功能研究奠定了良好的基础.     

小鼠体内外受精植入前胚胎全基因组甲基化模式比较

为考察体外受精、操作及培养环境对体外受精的小鼠植入前胚胎全基因组DNA甲基化模式的影响,本研究以体内受精的植入前胚胎作为对照,采用间接免疫荧光法检测小鼠体内外受精植入前胚胎基因组DNA甲基化模式.实验结果表明,体外受精各期植入前胚胎呈现出与之相应时期的体内受精植入前胚胎不同的DNA甲基化模式和水平,原核期甲基化水平较高,2-4-、8-细胞期明显降低,而桑葚胚和囊胚期又略有升高.各期体外受精植入前胚胎的基因组DNA甲基化水平都比同时期体内受精胚胎的甲基化水平低.本实验结果部分显示了体外受精、操作及培养环境可能对正常的DNA甲基化模式产生影响,造成体外受精植入前胚胎甲基化模式异常.     

高师生物教育专业实验教学现状及改革研究——来自阜阳师范学院生科院毕业生的调查报告

通过对阜阳师范学院生科院生物教育专业毕业生的问卷调查,发现了高师生物教育专业实验教学中存在的问题,并从实验室硬件建设、实验课程体系、实验教学目的、实验教学方式、实验管理体制以及实验教学评价等方面提出了改进思路。     

后生遗传修饰及其对动物克隆的影响

近年来,不断有新的哺乳动物和两栖类动物被成功克隆,但这并不能掩盖克隆效率过低和克隆动物异常的现实,为了解决这一问题,人们对克隆机理进行了大量研究。高度分化的体细胞核在去核的卵质中去分化和再程序化不完全是导致动物克隆失败的主要原因,而去分化和再程序化不完全主要是由于基因组去甲基化不充分和过早再甲基化引起克隆胚中甲基化水平比正常胚中偏高所至,这可引起一些重要基因的异常表达,尤其是印记基因。这些机制的研究对提高克隆效率有着重要意义。     

兔胚胎时期特异性基因相关新片段的克隆

阶段特异性基因的表达是早期胚胎发育过程中的重要事件,对植入前胚胎基因表达模式的研究是进一步研究植入前胚胎发育调控机制的前提。本实验利用mRNA差异显示技术来研究兔(Oryctolagus cuniculus domestica)植入前各期胚胎的基因表达差异。在获得的42个阳性阶段特异性表达的基因中,有5个在NCBI和EMBL数据库中没有同源序列,登录EMBL,申请了登录号。这些新基因片段都是桑葚期特异表达的基因,而且在以后的囊胚期也有表达。兔由母源型调控向合子型调控的过渡是在8～16细胞期开始的,在桑葚期开始表达的这些基因片段应该是兔胚胎时期特异性基因。这些基因的克隆将为进一步研究兔的植入前胚胎发育模式奠定基础。     

兔IFRG基因的克隆及表达分析

实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG。通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达。将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41（c）经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41（c）-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达。     

转录因子Oct4、Sox2和Nanog在早期胚胎发育过程中的表达调控

胚胎发育的分子机理是现今胚胎工程及发育生物学研究迫切需要了解的。由于胚胎发育的早期阶段就是胚胎干细胞阶段,因此两者在研究上有很好的重合性。通过对调节胚胎干细胞基因转录的三个具有代表性的转录因子Oct4、Sox2和Nanog的综述,展现出胚胎发育分子机理研究概况。