基于单碱基延伸标签反应的常见食源性致病菌基因芯片检测方法的建立

针对8种常见的食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌),建立了基于单碱基延伸标签反应原理的基因芯片检测方法。筛选和整合8种食源性致病菌基因组中的特异性序列和相应PCR引物,致病菌靶DNA片段被扩增和纯化作为单碱基延伸标签反应的模板,反应产物在DNA芯片上与探针进行杂交反应,然后通过扫描基片的荧光强度进行判断。实验结果表明,可采用基于单碱基延伸标签反应的基因芯片方法同时特异性检测8种食源性致病菌,基因组DNA多重检测灵敏度可达到0.1pg,以鼠伤寒沙门氏菌为单一检测对象的细菌纯培养物灵敏度可达到5×102CFU/mL。本方法可以快速灵敏地检测食源性致病菌,为食源性疾病的诊断和防治提供了一个有效的方法。     

吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌的近期疗效、毒副反应及疗效的影响因素分析

摘要 目的：探讨吉非替尼治疗表皮生长因子受体（EGFR）突变型晚期肺腺癌的近期疗效、毒副反应及疗效的影响因素。方法：选取2018年4月~2019年6月期间我院收治的EGFR突变型晚期肺腺癌患者97例。所有患者均给予吉非替尼治疗,观察其近期疗效及毒副反应情况。采用单因素和多因素 Logistic回归分析疗效的影响因素。结果：97例患者全部如期完成治疗,近期疗效评价：完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、病情稳定（SD）、病情进展（PD）率分别为9.28%（9/97）、24.74%（24/97）、31.96%（31/97）、34.02%（33/97）。根据近期疗效结果将患者分为有效组（CR+PR,n=33）和无效组（SD+PD,n=64）。本研究中患者的毒副反应多为 I、Ⅱ度非血液学毒性,最常见的是皮肤毒性,如皮疹等;其他毒副反应如胃部不适、腹泻等,经对症治疗后均能缓解。单因素分析结果显示,吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌的疗效与性别、肿瘤临床分期、骨转移、肿瘤直径有关（P<0.05）,而与年龄、肾上腺转移、脑转移、吸烟史无关（P>0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示,性别为男性、肿瘤分期Ⅳ期是影响吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌疗效的危险因素（OR=1.473、2.042,P<0.05）。结论：吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌具有不错的近期疗效,不良反应较少,性别为男性、肿瘤分期Ⅳ期是影响吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌疗效的危险因素。     

添加有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法

【目的】发掘副溶血弧菌特异性更强的检测靶点,并人工构建扩增内标,建立可以有效避免假阴性的新PCR检测体系。【方法】利用生物信息学方法,从副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)基因组DNA中发掘特异性很高的序列,并设计相应的特异性引物,人工构建扩增内标,建立PCR检测体系。【结果】本研究发掘得到的序列vp1332特异性很强,经检索,该序列是编码ABC转运子接合蛋白组分的基因片段,根据此序列设计一对特异检测引物(vp1332L/vp1332R),同时,构建了扩增内标,并建立了PCR检测体系。利用该体系对296株副溶血弧菌和33株非副溶血弧菌进行检测,结果显示,所有以副溶血弧菌为模板的PCR反应均可扩增到一条343bp的特异片段,而模板来源于非副溶血弧菌的则只能扩增到一条499bp的扩增内标片段。灵敏度实验表明,该PCR反应体系的检测灵敏度为1.6×102cfu/mL。人工污染实验表明,起始染菌量为1.24cfu/25g样品时经8h增菌,即可检测到副溶血弧菌。实际样品检测结果也证实该方法的有效性。【结论】本研究建立的PCR反应体系能特异地检测副溶血弧菌,并可有效地排除假阴性,提高检测准确率。     

原壳小球藻番茄红素ε环化酶基因的克隆和分析

摘要：【目的】番茄红素ε环化酶（lycopene epsilon cyclase）是叶黄素代谢途径中处于分支位点的关键酶。它催化线性的番茄红素选择性环化,形成胡萝卜素,再进一步合成叶黄素（lutein）。本研究的目标是克隆原壳小球藻（Chlorella protothecoides CS-41）LCYE基因的全长cDNA,通过该基因的生物学信息分析预测其表达产物的空间结构与功能位点,并验证该表达产物的生物学活性。【方法】采用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends）和RT-PCR技术克隆原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA序列。分别采用PredictProtein、Pfam HMMs和Swiss-Model等在线分析软件分析LCYE的基本生物学信息,预测蛋白质功能位点和空间结构。利用pET28-a(+)构建LCYE基因的原核表达质粒pET-LCYE,并转入大肠杆菌BL21（DE3）,再利用IPTG诱导LCYE基因超量表达。此外,携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌能够积累番茄红素,可用于验证LCYE基因编码蛋白的酶活。【结果】获得了原壳小球藻的LCYE基因的cDNA序列,长2107 bp,GenBank登录号为FJ752528。序列分析表明：它含有1731 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码576个氨基酸,与高等植物和其他藻类的LCYE有很高的相似性,其中相似性最高的是莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii XM001696477.1）,达到67%。第48～459个氨基酸残基为一个典型的番茄红素环化酶蛋白（Lycopene cyclase protein）结构域（pfam05834）,第261～284个氨基酸残基为一个典型的环化酶保守的模体。SDS-PAGE检测表明,LCYE基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了超量表达。携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌在获得LCYE基因后,其颜色从粉红色变为黄色。【结论】原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA为2107 bp,预测出番茄红素ε环化酶所特有的保守功能区域,构建了它的三维结构模型。同时,阐明了小球藻和衣藻的亲缘关系。最后,证实了本研究克隆到的LCYE基因编码的蛋白具有番茄红素ε环化酶的功能与活性。     

添加有扩增内标的沙门氏菌荧光定量PCR 检测体系的建立与评价

【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引物法构建扩增内标,优化参数,建立沙门氏菌内标PCR检测体系,利用特异性和灵敏度实验评价体系的检测性能。【结果】筛选得到的新特异靶点基因编码III型分泌系统蛋白(ssaQ)。针对该基因设计特异引物(SsaQ6),建立了添加有扩增内标的常规PCR和EvaGreen荧光定量PCR检测体系;二者对151株沙门氏菌和34株非沙门氏菌的检测符合率均达100%,对基因组DNA的检测下限达14.9拷贝/PCR和2.76拷贝/PCR;人工污染牛奶样品(初始染菌量:4-6 cfu/10 mL),増菌10 h和8 h后分别可检出沙门氏菌。【结论】本研究发掘的新靶点基因ssaQ特异性强,基于这一新靶点建立的添加有扩增内标的EvaGreen荧光定量PCR比常规内标PCR的检测限更低,重复性更好,快速方便,在12 h内即可得出检测结果,并且定量准确,有利于推进沙门氏菌PCR检测方法的标准化应用。     

添加有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法的建立

摘要：【目的】发掘副溶血弧菌特异性更强的检测靶点,并人工构建扩增内标,建立可以有效避免假阴性的新PCR检测体系。【方法】利用生物信息学方法,从副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）基因组DNA中发掘特异性很高的序列,并设计相应的特异性引物,人工构建扩增内标,建立PCR检测体系。【结果】本研究发掘得到的序列vp1332特异性很强,经检索,该序列是编码ABC转运子接合蛋白组分的基因片段,根据此序列设计一对特异检测引物（vp1332L/vp1332R）,同时,构建了扩增内标,并建立了PCR检测体系。利用该体系对296株副溶血弧菌和33株非副溶血弧菌进行检测,结果显示,所有以副溶血弧菌为模板的PCR反应均可扩增到一条343 bp的特异片段,而模板来源于非副溶血弧菌的则只能扩增到一条499 bp的扩增内标片段。灵敏度实验表明,该PCR反应体系的检测灵敏度为1.6×102 cfu/mL。人工污染实验表明,起始染菌量为1.24 cfu/25 g样品时经8 h增菌,即可检测到副溶血弧菌。实际样品检测结果也证实该方法的有效性。【结论】本研究建立的PCR反应体系能特异地检测副溶血弧菌,并可有效地排除假阴性,提高检测准确率。     

恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者诊断中的应用

目的评价恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者下呼吸道感染病原体检测中的效果。方法收集合格痰标本146例,通过恒温扩增芯片法和细菌培养法检测病原体,对两种方法检测结果进行分析。结果 146例痰液标本中,恒温扩增芯片法检出阳性标本114例(阳性率为78.1%),其中单一致病菌感染42例,2种及以上致病菌混合感染72例。45例标本检测到mecA基因,其中13例为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。146例痰标本中,有109例痰标本同时进行了痰培养检测,痰培养阳性率为67.9%(74/109),相应的恒温扩增芯片法检测阳性率为82.6%(90/109);痰培养结果阴性共计35例,与之相符合的恒温扩增芯片法检测阴性共计16例(阴性符合率45.7%)。恒温扩增芯片法对肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌的阳性检出率明显高于痰培养,差异具有统计学意义。恒温扩增芯片法检测到2例结核分枝杆菌复合群、1例军团菌、1例肺炎支原体,痰培养检测到3例奇异变形杆菌。结论本实验室所开展的恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染者下呼吸道病原体检测方面的优势体现在阳性率高、检测时间短,可为临床肺部感染诊断提供及时准确的参考依据。