饲料中维生素和无机盐对rBmNPV-Bm表达系统植酸酶基因表达活性的影响

【目的】为查明宿主的营养对重组家蚕杆状病毒-家蚕表达系统(rBmNPV-Bm)外源基因表达活性的影响,探寻提高家蚕Bombyx mori生物反应器产率的新途径。【方法】以家蚕BmNPV病毒为表达载体,以人工饲料饲养的5龄家蚕为宿主,以植酸酶基因为报告基因,探讨了家蚕人工饲料中维生素和无机盐对外源基因表达产物活性的影响。【结果】家蚕血淋巴中外源植酸酶的活性随着饲料中维生素和无机盐添加量的不同而发生显著变化。在本试验设区范围内,当维生素C的含量为饲料干物质量的1 %,B族维生素混合物为0.25 %,无机盐混合物为1 %,维生素B6为100 g饲料干物中含2 mg时,血淋巴中植酸酶活性达到最大值。【结论】通过改变家蚕饲料中微量营养成分的含量是提高rBmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的有效途径。     

猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达

为研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus PEDV)S基因片段的原核表达产物是否具有抗原性,分析S基因抗原位点后,用PCR技术扩增S蛋白主要抗原区的核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,成功构建了重组质粒pET-28a-PEDV-Sp,其重组菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h后进行SDS-PAGE分析,在分子质量约为29 kDa处出现一新蛋白带,与预期相符。质谱鉴定表明,已成功表达了目的蛋白。纯化后的重组蛋白免疫兔制备多克隆抗体,抗体效价检测结果显示该蛋白具有良好的抗原性。该研究为猪流行性腹泻基因工程疫苗的研制奠定基础。     

鸡κ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测

干扰素（interferon,IFN）是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定。用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞（CEF）的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上。高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据。     

铁蛋白与口蹄疫病毒VP1在大肠杆菌中融合表达及纳米颗粒自组装

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的世界上最重要的畜牧疾病之一,严重影响世界畜牧业的发展,而疫苗免疫仍然是对疫情预防和控制的最有效手段。铁蛋白具有自组装和生物修饰的特性,在纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景。选用O型口蹄疫病毒的vp1基因和幽门螺杆菌铁蛋白基因,通过融合PCR将vp1基因构建到铁蛋白亚基基因前端,在大肠杆菌中表达后通过His标签进行镍柱亲和层析纯化。将纯化好的重组蛋白进行Western blotting检测、质谱分析和透射电镜观察,发现重组蛋白VP1-Ferritin在大肠杆菌中获得表达,并可自组装成纳米颗粒。     

一种棉铃虫多角体病毒的纯化与鉴定

对一株纯化的棉铃虫多角体病毒进行电镜观察,形态呈不规则型,直径约2 μm,命名为棉铃虫多角体-B(Helicoverpa armigera nucleocapsid nucleopolyhedrovirus-B,HaNPV-B),它对东方粘虫有较好的感染性,与棉铃虫单核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid NPV,HaSNPV)有不同的宿主域.通过半补齐法建立HaNPV-B基因组文库,拼接了一个6 035 bp的核苷酸片段,推测包含6个ORF,其包含基因内容及基因结构与HaSNPV不同,分析表明两者是不同种病毒,这为杆状病毒与宿主的相互作用及共同进化提供了信息.     

利用BmNPV-家蚕表达系统包装重组腺相关病毒2型（rAAV2）研究

腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统（AcMNPV-sf9）包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）。首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因和荧光素酶（luciferase,Luc）基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE（cytomegalovirus-IE,CMV-IE）启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上。随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒reBmBac共转染BmN细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）。再将纯化的重组病毒（reBm-Cap2、reBm-Rep2）与reBm-EGFP、reBm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒。利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否。结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达。     

鸡贫血病毒VP1和VP1蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与CunI酶切线性化的亲本病毒Bm-Bacpak6DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCC－MSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒（Recombinant BmNP)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子及增强子hr3功能分析

从BmNPVZJ8株克隆了解旋酶（helicase)基因ATG上游的510bp启动子,序列分析发现,该启动子同时具有早期和晚期RNA转录起始位点,将起始密码突变为ATT后,引入萤火虫荧光素酶（Luc)基因作瞬时表达分析,用表达质粒pBmhel510luc转染Bm-5和Sf-21细胞,解旋酶基因启动子能被细胞的RNA聚合酶识别,具有早期启动子的特性,且病毒因子对hel510启动子具有反式激活作用。杆状病毒同源重复区（hr)序列是病毒DNA复制起始点,又具有增强子功能,将BmNPVhr3序列克隆到hel510启动子的下游进行瞬时表达,结果表明,hr3可增强hel510启动子在昆虫细胞和家蚕幼虫中的转录活性分别在7000倍和1000倍左右。