人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。     

实时逆转录PCR检测G1、G2和G4型轮状病毒方法的建立

目的建立3种用于检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因的一步法实时逆转录PCR,用于本实验室G1、G2和G4型轮状病毒的快速检测和定量、定性分析。方法设计G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针,采用G1、G2和G4型轮状病毒特异性体外转录RNAs,建立实时逆转录PCR,特异性检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因方法。结果 3种实时逆转录PCR标准曲线R~2均大于0.99,扩增效率均在90%～110%之间。不同浓度体外转录RNAs重复性检测结果 CV均5%,且可以对单拷贝RNAs样本进行检测。结论本检测方法快速、灵敏且重复性好,可以对轮状病毒VP7基因进行特异而有效的检测,为实验室轮状病毒毒株的分型和定量检测提供了特异而有效的检测方法,也为今后多重实时逆转录PCR的建立奠定了试验基础。     

两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。     

Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗稳定性研究

为了研究Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗的稳定性,对2~8℃、25℃、37℃放置不同时间的9批成品疫苗定期取样观察外观物理性状、检测病毒滴度。结果表明,在2~8℃可保存两年以上,疫苗滴度保持不变;在25℃放置2周、37℃放置1周后疫苗滴度开始下降,因此,该疫苗在贮存、运输以及使用过程中环境温度应以2~8℃为宜。     

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。     

硫酸镍对人红细胞膜Na~+、K~+、Ca~(2+)-ATP酶及乙酰胆碱酯酶活力的影响

实验研究了硫酸镍对人红细胞膜Na+、K+、Ca2+-ATP酶及乙酰胆碱酯酶(AChE)活力的影响,为从分子水平阐明镍毒作用机理及为探索防治措施提供依据。结果表明,硫酸镍对此三种酶均有抑制作用,并呈现较高的量效关系及时效关系。     

细胞工厂在轮状病毒基因重配株LD9培养中的应用初探

为了探索用细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株LD9及收获高滴度的LD9病毒原液和提高产量的可行性,分别在2层4、层细胞工厂和3L1、5L转瓶培养Vero细胞,比较两种容器内细胞的生长状态。结果显示,以相同活细胞数2.5×104/ml同时接种两种不同培养容器时,细胞工厂培养3d已长成单层,而转瓶培养需5d;对两种容器长满单层时的细胞经胰酶消化后通过细胞仪计数、分析,结果显示,两种容器培养细胞长成单层时的单位面积细胞密度相当;对长成致密单层细胞的两种容器以相同的MOI(MOI=0.1)接种LD9病毒,转瓶培养的病毒于第8d病毒滴度达到高峰,为6.0～6.5 lgCCID50/ml;细胞工厂第5d病毒滴度达高峰,为6.5 lgCCID50/ml,并于第9d病毒滴度再次达到峰值,为6.0～6.5 lgCCID50/ml,实现二次收获病毒。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的表达差异研究

目的构建呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的原核表达载体,并对它们在大肠杆菌中的表达差异进行了初步研究。方法用DNAstar软件对呼吸道合胞病毒F1蛋白进行亲疏水性和抗原表位可能性分析后,将其两端的疏水区域截去之后与pET-42b(+)构建表达载体,同时用相同的表达系统构建F1蛋白的表达载体并将2种重组蛋白进行诱导表达。实验对2种蛋白在Rossata/pET-42b(+)菌株中的表达难易度、表达形式及初步洗涤的包涵体纯度进行了比较。结果与F1蛋白相比,截短的F1蛋白相对更容易表达,表达的可溶性蛋白含量更高,洗涤纯化后的包涵体纯度也更高。结论呼吸道合胞病毒F1蛋白截去两端疏水氨基酸后更容易表达,为后期蛋白的大量制备及其免疫原性研究奠定了基础。     

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。