用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达，降低肝细胞中胆汁酸的分泌

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02).根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量.利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P＜0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌.以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础.     

神经元限制性沉默因子在NTera2/CloneD1细胞向神经元分化模型中表达的检测

目的:建立NTera2/CloneD1细胞向神经元分化的模型,检测神经元限制性沉默因子(NRSF)经分化培养基诱导后表达的变化。方法:收集正常培养的NTera2/CloneD1细胞及经全反式维甲酸(RA)、阿糖胞苷(AraC)、尿苷分阶段诱导共28 d的细胞,显微镜下观察诱导前后细胞的形态学变化;免疫荧光法检测NTera2/CloneD1细胞诱导前后干性标志Nestin、Sox2和成熟神经元特异性标志NF-200、β-tubulinⅢ的表达情况;应用RT-PCR和免疫荧光法对NRSF进行mRNA和蛋白水平的检测。结果:显微镜下观察到正常培养的NTera2/CloneD1细胞呈克隆样生长,经分化培养基诱导后的NTera2/CloneD1细胞表现出典型的神经元样细胞形态。免疫荧光检测表明,未诱导的NTera2/CloneD1细胞表达神经干细胞的标志Sox2、Nestin,不表达成熟神经元特异性蛋白NF-200、β-tubulinⅢ;而经RA等诱导分化的细胞则不表达Sox2、Nestin,表达NF-200、β-tubulinⅢ。RT-PCR和免疫荧光检测显示,NRSF在诱导分化后的NTera2/CloneD1细胞中的表达量显著降低。结论:建立了NTera2/CloneD1细胞向神经元分化的模型,NRSF在诱导后的NTera2/CloneD1细胞中表达量显著下调,提示NTera2/CloneD1细胞在诱导过程中可能通过下调NRSF,使受到NRSF负性调控的神经元特异性蛋白启动表达并上调,进而实现NTera2/CloneD1细胞向神经元的定向分化。     

神经元限制性沉默因子与胰岛素在成年小鼠胰腺中的表达

目的:观察神经元限制性沉默因子(NRSF)在正常成年小鼠胰腺组织中的表达情况。方法:以6～8周BALB/c小鼠胰腺为实验材料,制备冰冻切片,与地高辛标记的NRSF cDNA探针进行原位杂交,观察mRNA表达,并结合免疫组织化学方法检测NRSF和胰岛素的表达。结果:原位杂交显示,NRSF mRNA仅表达于胰腺组织外分泌部腺泡腺细胞中,胞浆呈蓝紫色,与免疫荧光组织化学检测NRSF蛋白表达的部位一致,而胰岛细胞中无NRSF mRNA及蛋白的表达。免疫酶组织化学染色显示,胰岛大部分细胞中表达胰岛素,胞浆染成黄棕色,而腺泡腺细胞则不表达胰岛素。结论:NRSF与胰岛素不存在共定位关系,即成年小鼠胰岛细胞不表达NRSF,而表达胰岛素。提示NRSF蛋白表达的消失可能是建立完全分化成熟、具有完好分泌反应的胰岛细胞所必需的。     

Wnt 3a在神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中作用的研究

Wnt信号在中枢神经系统发育过程中起重要的作用,控制着细胞的生长及分化.Wnt3a是Wnt家族的成员之一,对神经干细胞的增殖及分化有一定的调控作用.将重组Wnt3a腺病毒转入神经干细胞中,研究Wnt3a在定向诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中的作用.将神经干细胞分为4组,对照组(不加任何诱导因子组)、抗坏血酸诱导组(AA组)、Wnt3a重组腺病毒诱导组(Wnt3a组)以及Wnt3a重组腺病毒加抗坏血酸诱导组(Wnt3a AA组).结果显示,Wnt3a组细胞中的多巴胺能神经元前体细胞特异性标志Nurr1表达量显著增多,Wnt3a AA组多巴胺能神经元明显多于AA组,酪氨酸羟化酶(TH)在mRNA水平上的表达是AA组的1.86倍.蛋白质印迹及免疫细胞化学染色显示,各诱导组均有TH的表达,Wnt3a组和AA组多巴胺能神经元阳性细胞数比例分别为(5.76±3.34)%和(37.42±2.54)%,与Wnt3a AA组(73.96±2.61)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).利用高效液相色谱法检测到诱导后的细胞可分泌多巴胺.结果表明,Wnt3a可促进神经干细胞向多巴胺能神经元前体细胞分化,再通过抗坏血酸的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元,这些神经元有分泌多巴胺的功能.     

小G蛋白RhoA与细胞发育

细胞发育是细胞内各种复杂反应在时间和空间上有序协调的过程, 包括细胞增殖、胞质分裂、细胞运动、细胞分化和组织生成等．作为G蛋白家族重要成员的RhoA起了重要的调控作用：在G蛋白调控因子(如GEF XPLN、 p115RhoGEF、p190RhoGAP等）的作用下,活化的RhoA依次与效应蛋白分子（如ROCK1/2、 mDia、 PRK1/2、 citron 激酶等）结合, 从而开启了下游的信号通路, 最终使细胞能够迅速地对外界刺激做出反应．干细胞是一类既能自我更新又能特异分化形成终末分化细胞的细胞, 而 RhoA对干细胞的自我更新和定向分化也起着“开关"作用, 对RhoA信号通路的调节调控了胚胎发生、神经发生、造血生成及成骨和肌肉生成等干细胞分化发育过程．肿瘤是正常细胞在各种因素长期作用下增殖异常的产物, 而RhoA异常表达与肿瘤的发生、侵润与转移密切相关, RhoA信号通路与p53等基因的交互作用在肿瘤的发育过程中也发挥了重要的作用．     

miR-155对肝癌细胞增殖的影响

目的:在肝癌细胞系中过表达miR-155,研究其对肝癌细胞增殖的影响。方法:将pc DNA3.0-miR-155表达载体瞬时转染Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系,通过实时定量PCR技术对miR-155在转录水平的表达进行检测,采用CCK8法及克隆形成实验检测miR-155过表达后对Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系增殖的影响。结果:转染细胞后72 h,经实时定量PCR检测,Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞中成熟miR-155的表达分别上调约431及16倍(P0.01),说明其能有效高表达;CCK8法及克隆形成实验结果显示,miR-155能够明显促进肝癌细胞增殖(P0.01)。结论:pc DNA3.0-miR-155转染Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系后能高效表达成熟miR-155,同时证明过表达miR-155能使肝癌细胞的增殖受到非常明显的促进。