一例日本囊对虾暴发性死亡的病原分析

为了阐明山东省潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)7种病原的检测,且对发病对虾进行了常规组织病理学观察。同时采用16S r DNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示,发病对虾样品核酸检测呈现WSSV强阳性,IHHNV和CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。组织病理学观察发现,在对虾的胃、鳃等上皮组织中存在WSSV包涵体,头部肌肉纤维出现离散。对分离编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果显示,3株菌分别与印度格里蒙菌、交替单胞菌及溶藻弧菌相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示,3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×107、1.1×108与2.3×108 CFU/m L,各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。研究表明,导致本次日本囊对虾暴发性死亡的病因与混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有关,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发性死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

人工养殖对虾肠道内可培养细菌数量及组成分析

为深入了解人工养殖条件下养殖对虾肠道内菌群结构和携带病毒情况,应用常规细菌分离、培养与纯化,细菌16S rD NA序列分析的方法分析了我国山东、江苏、韩国不同养殖场的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中国明对虾(Fenneorpenaeus chinensis)肠道内可培养细菌的总数、优势菌组成和数量,并用巢式聚合酶链式反应(Nested polymerase chain reaction,Nested PCR)方法检测对虾携带病毒情况。结果显示各批次凡纳滨对虾和中国明对虾样品肠道内的可培养细菌总数在105~109cfu/g之间,并对分离出的优势菌进行属(种)鉴定,结果表明这些优势菌分别属于乳球菌属(Lactococcus sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、微小杆菌属(Microbacterium sp.)。凡纳滨对虾和中国明对虾均有样品检测为WSSV阳性,6批次WSSV阳性对虾样品中均检测到弧菌属细菌,占可培养细菌比例为33%~93.58%。2批次WSSV阳性对虾样品中检测到希瓦氏菌属细菌,占可培养细菌比例为21.67%~34.21%。4批次WSSV阳性对虾样品中检测到发光杆菌属细菌,占可培养细菌比例为21.03%~66.83%。     

采用OIE标准检测养殖对虾中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的PCR检出类型

利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的4对引物(389F/R、392F/R、77012F/77353R 和309F/R),通过普通 PCR 方法,对本实验室2011?2012年采集于国内不同地区的对虾样品进行 IHHNV(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)检测,并对国内存在的 IHHNV 检出类型进行初步分析。检测结果显示,在凡纳滨对虾、斑节对虾、中国对虾、宽沟对虾中均检测出了 IHHNV,而在脊尾白对虾中未检出。其中凡纳滨对虾阳性率最高,中国对虾阳性检测率最低。对虾样品2011年阳性率高于2012年,华东地区高于华北、华南两地。此外,根据4对引物的检测结果,得到国内 IHHNV 的4种 PCR 检出类型。     

白斑综合征病毒2014年中国毒株变异区的序列比较

为研究白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在中国不同地区的分子流行病学变异特征,对2014年1-8月期间在病害暴发区采集到的48份PCR检测阳性样本,用ORF75、ORF94和ORF125引物扩增目的片段,连接转化已克隆目的片段,测序分析不同样本ORF75、ORF94和ORF125重复序列数目的差异.结果显示,不同地区毒株ORF75的重复单元数目有4、10、11、12、13不等,ORF94的重复单元数目有4和14,而ORF125的重复单元数目有0、3、5、6、7不等.结果表明,流行在中国大部分地区的WSSV存在一定程度变异,毒株间的变异在ORF75、ORF94和ORF125上比较明显.     

2017年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区的序列分析

白斑综合征病毒(WSSV)自暴发以来给全球范围内的对虾养殖产业带来了巨大的损失。为了解我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖区WSSV的流行变异情况,选取2017年中国部分地区的42个WSSV阳性样本,对ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125共5个可变区进行PCR特异性扩增,分析其序列的缺失变异和重复单元(Ru)中单核苷酸多态性的变化。研究结果显示,在ORF14/15的扩增中共出现4种缺失片段;ORF23/24只出现11945bp的缺失片段;ORF75扩增中,总RUs数目为3、4、9,其中45bp的RUs在12、27、80位点发生多核苷酸多态性;ORF94的RUs数目为6,其各重复单元在48位发生单核苷酸多态性;ORF125的RUs数目为4、6、7不等,其各重复单元分别在20、27、50、53、61位发生碱基突变。研究结果表明,2017年样本中,WSSV在中国大部分地区均出现一定程度的缺失变异,其中部分可变区表现出缺失情况的稳定性,某些可变区的重复单元数目及SNP表现出地区的差异性以及不稳定性。     

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

γ-氨基丁酸的抗应激作用及在畜禽夏季日粮中的应用

我国大部分地区夏季炎热期长达3个月之久,长江以南地区的高温高湿天气持续时间则更长,加之现代工厂化、集约化畜牧生产方式中密集饲养的特点,导致炎热夏季的高温高湿天气不可避免地会对畜禽造成慢性或急性热应激,而应激尤其是高温应激条件下,畜禽的生产性能及养殖效益都大大降低.     

凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析

对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量,用Taq Man q PCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。结果显示,在主要生长相关参数中,RZ群体最优,该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异,HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布,而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布,代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中,各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺中肠血淋巴鳃肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P0.001);除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外,其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P0.01)或显著(P0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示,肝胰腺是主要的EHP感染组织,其他组织中杂交信号较弱,但各组织中有少数细胞的EHP易感。