荧光素酶互补法对谷子中SiPKS32/SiCaBP5的互作研究

盐害极大影响了作物的产量和品质。SOS信号途径作为植物耐盐性的重要信号通路,主要包括三类基因,即SOS1、SOS2和SOS3,其中SOS2和SOS3复合物的形成,对于激活SOS1从而行使SOS信号通路维持离子稳态及参与植物抗盐胁迫的功能具有重要作用。谷子作为抗逆耐贫瘠作物,解析其是否存在SOS信号途径及其在盐胁迫下的响应模式具有重要意义。本研究参考已知SOS2、SOS3基因序列,在谷子中同源克隆SOS2基因SiPKS32、SOS3基因SiCaBP5,并进一步构建了SiPKS32、SiCaBP5基因与荧光素酶片段cLUC、nLUC的融合表达载体,利用烟草瞬时荧光素酶互补系统分析基因互作情况。结果显示,SiPKS32与SiCaBP5共侵染烟草可产生荧光,基因间存在互作。该结果为探索谷子中是否存在SOS信号通路及其调控网络,进而为利用基因工程手段培育抗逆作物新品种奠定基础。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体蛋白激酶FTPK1的互作蛋白

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases, RLKs)作为重要的信号分子受体,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用,因此鉴定RLKs的底物蛋白对于其功能的研究至关重要。本研究利用酵母双杂交系统对FTPK1的互作蛋白进行筛选,初步确定了两个候选蛋白,为进一步研究该激酶的功能奠定了基础。     

应用定量蛋白质组学对谷子干旱响应蛋白的研究

谷子是我国的传统优势作物,具有抗旱、耐瘠薄、高光效以及基因组小、生育期短等突出优势,受到国际遗传学界的高度重视,已迅速发展成为功能基因组研究新的候选模式作物。但目前在蛋白质水平上解析谷子干旱响应的研究还较少。本研究利用TMT(tandem mass tags)体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术,筛选并鉴定谷子干旱响应蛋白。研究发现谷子干旱响应差异蛋白主要参与胁迫响应、碳代谢、光合作用和蛋白合成等相关代谢途径。该研究对于深入解析谷子的抗旱机制,培育抗旱耐逆谷子新品种具有重要意义。     

光敏色素互作因子(PIFs)对植物生长发育的调控

光敏色素相互作用因子(PIFs)属于拟南芥bHLH转录因子家族的第15亚族,是光信号响应过程中的关键负调控因子。光激活的光敏色素通过促进PIFs蛋白降解,直接或间接抑制它们与DNA的结合,从而实现光对植物生长发育的调控。研究发现PIFs在调控种子萌发、幼苗形态建成、避荫反应、昼夜节律以及各种植物激素响应过程中起着重要作用。此外,PIFs作为细胞信号传导的"枢纽"具有更为广泛的作用,能够整合不同信号,精细调控整个转录网络。     

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因OsSRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子OsSRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】OsSRL为组成型表达,OsSRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。OsSRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】OsSRLp为组成型启动子,其下游调控基因OsSRL可能参与水稻发育及生殖过程。     

NaCl处理谷子萌发期种子的转录组学分析

【目的】谷子具有抗旱、耐贫瘠的特性,逐渐成为研究禾本科作物的模式作物。本研究以前期筛选并获得的谷子耐盐品种和敏感品种为材料,通过RNA-Seq测序筛选鉴定谷子的盐胁迫响应基因,揭示其响应盐害机制,为培育谷子抗盐新种质提供理论依据。【方法】 对14个谷子品种进行了萌发期抗盐筛选。谷子不同品种的种子经150 mmol·L ^-1NaCl处理萌发培养7 d后,分别统计各品种种子的萌发率、根长和芽长,综合各项指标鉴定到豫谷2为耐盐品种、安04为盐敏感品种。以这两个品种盐胁迫前、后萌发期种子为材料,应用RNA-Seq进行转录组测定,分析鉴定盐害下差异表达基因（differentially expression gene,DEG）,并对DEG进行GO和KEGG功能富集分析。同时应用qRT-PCR对随机挑选的15个DEG表达模式进行验证,并与RNA-Seq结果进行相关性分析。 【结果】 耐盐品种豫谷2、盐敏感品种安04种子经盐胁迫处理后,分别鉴定出2 786个和4 413个DEG;其中,每个品种在NaCl处理前及处理后分别鉴定出1 470和3 826个DEG。GO和KEGG聚类分析显示,NaCl处理下参与信号转导、抗氧化、有机酸的合成及转运以及次生代谢等相关的DEG在谷子萌发期种子应对盐胁迫响应过程中具有关键性的作用,DEG主要集中在胁迫响应、离子的跨膜转运、氧化还原、次生代谢及有机酸、多胺、苯丙烷的合成等过程。qRT-PCR对15个DEG表达模式的检测结果与RNA-seq结果相关系数为0.8817。其中编码离子通道的基因（HKT）、过氧化物酶基因（POD）、黄烷酮-3-羟化酶基因（FL3H）、MYB转录因子基因等在豫谷2中表达量较高,显示其在谷子萌发期种子响应盐胁迫中可能发挥一定作用。【结论】 谷子耐盐品种及盐敏感品种的种子对盐胁迫的响应程度具有一定的差异性,且品种对盐害的耐受能力主要与基因对胁迫的响应程度相关,而与DEG的数量相关性不大。     

干旱胁迫下谷子的转录组分析

谷子作为我国的传统优势作物,具有抗旱、耐瘠薄、基因组小等突出优势,已逐渐发展为研究禾本科作物新的模式作物。利用高通量RNA-seq技术,我们对干旱胁迫6 h和6 d的谷子进行转录组测定,筛选表达差异基因。结果显示,干旱胁迫后的差异基因主要富集在生物学通路及代谢通路中,其中编码蛋白激酶、磷酸酶、信号转导组分、转录因子、功能蛋白等基因的表达变化较明显。尤其在干旱胁迫6 d后,谷子中E3泛素连接酶介导的泛素蛋白酶体途径被明显激活。该研究对于筛选谷子抗旱基因进而揭示谷子的抗旱机制提供了重要依据。     

水稻类受体蛋白激酶FTPK1的原核表达及其活性检测

类受体蛋白激酶(receptor-like kinase,RLKs)是植物信号分子的受体,它能够通过胞内激酶域对底物进行磷酸化或去磷酸化,从而对下游靶基因的转录及表达进行调控,参与胞内信号转导,在植物生长发育及环境应答过程中发挥作用。本研究以水稻"中花11"cDNA为模板,通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因FTPK1的全长序列,进一步构建原核表达载体p ET-28a-FTPK1后,经1 mmol/L IPTG诱导12 h,获得88k D的诱导表达蛋白条带,显示FTPK1可在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经Ni柱纯化及透析后,获得纯化的融合蛋白。FTPK1激酶活力检测显示,其可磷酸化蛋白底物His和MBP,具有一定的磷酸化活性。本研究为进一步制备FTPK1特异性抗体,深入解析其理化特性及生物学功能奠定了基础。     

盐胁迫下谷子根部细胞内pH值测定

利用BCECF-AM荧光染料和激光共聚焦显微镜测定谷子根部细胞内的荧光强度,进而换算成细胞内pH值,以此来研建测定谷子根部细胞内pH值的方法。结果显示:正常水培条件下,谷子品种YG2和AN04根部细胞内pH值分别为5.85±0.11和5.77±0.26;盐处理下YG2和AN04根部细胞内pH值分别达到6.21±0.26和6.19±0.17,即盐敏感品种AN04根部细胞盐处理后pH值变化较大,提高7.28%,而抗盐品种YG2提高6.15%。这说明抗盐品种盐胁迫下细胞内pH值受外界环境影响较小,对盐害的耐受力较高。该方法用来定量测定细胞内pH值具有可信性,亦可作为评价植物耐受胁迫能力的辅助手段。     

水稻羧酸酯酶OsCDAP的生物学功能初探

本课题组在对水稻病害的研究中,鉴定并克隆到一个羧酸酯酶基因OsCDAP。为进一步研究该酯酶生物学功能,构建了OsCDAP植物过表达载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻"中花11"。转基因水稻表型分析显示,过表达转基因水稻植株株高略高于对照,其第一节间长度明显长于对照,而第五节间长度明显短于对照,其他节间长度差异不明显;OsCDAP过表达株系的剑叶夹角明显大于对照。进一步对转基因水稻GA和BR合成及信号转导相关基因进行分析,发现部分基因的表达发生改变。本试验结果显示OsCDAP可通过调控内源GA和BR的含量及参与相关信号途径调控水稻节间长度及叶夹角大小,进而对水稻的生长发育产生影响。