不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立

鹅星状病毒(GAstV)是近年临床新发病原,也是导致当前雏鹅痛风致死的主要病因,研究显示该病毒存在两种不同基因型。为建立快速准确的核酸鉴别诊断方法,本研究针对不同基因型GAstV保守域RNA依赖性RNA聚合酶序列各设计1对特异性引物,建立以RNA为模板的双重一步法RT-PCR检测方法。条件优化试验结果显示,双重RT-PCR方法彼此无干扰;引物特异性强,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒的检测均为阴性;体系中引物适宜浓度为1 μmol,退火温度范围广,50~54 ℃皆可;敏感性高,最低检测限分别为10³拷贝数和10²拷贝数。对采集自江浙地区的73份样品进行检测,结果显示,鹅星状病毒阳性率为93.2%,主要为Ⅱ型星状病毒的单一感染(阳性率86.3%),部分样品呈现两种类型星状病毒混合感染现象(阳性率6.8%)。上述结果表明本研究建立的双重RT-PCR方法可用于GAstV的鉴别诊断和分子流行病学调查。     

1株伪狂犬病病毒的基因变异及其对小鼠的致病性分析

本研究旨在了解我国猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)流行毒株的分子遗传变异及毒力特点。对1株分离自1个接种了Bartha-K61疫苗的规模猪场的PRV ZJ株进行了主要糖蛋白基因序列(gB、gC和gE)的测定分析及对6周龄BALB/c小鼠的致病性研究。遗传变异分析显示,该毒株与我国2012年后的流行毒株高度同源,具有变异毒株基因特征,但gE基因的510位氨基酸出现了不同于变异株的独特变化S⁵¹⁰G。ZJ株对小鼠具有较高的致病性,攻毒小鼠呈现典型的神经症状,以100 LD₅₀感染小鼠,第5天死亡率达100%。本研究为进一步探索该病毒的毒株变异特点与致病机理奠定基础。     

浙江地区鹅星状病毒分离鉴定及其衣壳蛋白多克隆抗体的制备

鹅星状病毒(GAstV)是当前鹅养殖业的重要病原,易引起雏鹅内脏痛风症状和死亡,造成巨大经济损失。于浙江省内采集30份病料,进行核酸检测、病原分离和测序,并克隆其ORF2序列至pET-28a原核表达载体,转化BL21菌株后经诱导获得衣壳蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,临床死亡雏鹅剖检均发现典型内脏痛风症状,核酸检测鉴定为鹅星状病毒阳性,且出现不同基因型鹅星状病毒混合感染情况。共分离得到ZJC14和ZJLD20两个毒株,其中,ZJLD20在鹅胚和LMH细胞中均稳定增殖,但ZJC14并不能适应LMH细胞。病毒基因组测序显示,ZJC14与ZJLD20亲缘关系较远,ZJC14属于GAstV-Ⅰ基因型,而ZJLD20为GAstV-Ⅱ基因型。重组表达载体pET28a-ORF2诱导后获得纯化目的蛋白,经免疫成功制备兔源多克隆抗体,该抗体可与目的蛋白结合。此外,间接免疫荧光和Western-blot试验结果显示,ZJLD20衣壳蛋白制备的多克隆抗体可与病毒结合反应。研究成果有利于后续对该病原致病能力的研究,同时,试验制备的ORF2衣壳蛋白与多克隆抗体为鹅源星状病毒感染的诊断试剂开发奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒弱毒株在雏番鸭体内的分布和排毒规律

为了解新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)弱毒株感染雏番鸭后在体内的分布和排毒规律,本研究采用传代致弱的NDRV JDm10-150毒株接种1 d龄雏番鸭,对接毒后6 h~35 d雏番鸭的血液、脑、胸腺、心、肝、脾、肺、肾、胰腺、法氏囊、盲肠扁桃体、咽拭子和泄殖腔拭子采用qRT-PCR方法检测病毒分布情况。结果显示:接6 h后,在各组织脏器及血清中可检到NDRV核酸,且肝和脾病毒含量最高。随后,各组织脏器及血清中NDRV核酸含量逐渐减少。接毒后9 d,各组织器官及血液均检测不到NDRV核酸或NDRV核酸检测为阴性(Ct>35)。接毒后第13~35 d,除脑和血清外,大部分的组织脏器中均又检测到NDRV核酸,且NDRV核酸含量基本稳定,其中脾脏和法氏囊组织中NDRV核酸含量始终保持较高水平。对不同时间采集的咽拭子和泄殖腔拭子进行检测,发现雏番鸭在接毒后6 h开始向外界排毒,之后通过泄殖腔排毒,直至攻毒后28 d停止排毒。以上检测结果表明,NDRV JDm10弱毒株感染雏番鸭后快速侵入各组织脏器和血液,脾脏和法氏囊为主要侵染和定殖场所,主要通过泄殖腔分泌物向外界排毒。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

浙江省地方鸡种禽白血病毒抗原检测与部分分离株GP85基因序列分析

为了解浙江地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis vrius,ALV-J)的感染情况与流行毒株的分子特征,对浙江省部分地方品种鸡体内ALV的p27抗原进行了检测,从疑似感染鸡群中检测分离到5株 ALV-J,并对其GP85基因进行PCR分子克隆和序列分析。研究结果显示:在检测的19个地方鸡品系中,所有品系的鸡样本都呈现抗原阳性,其中101系的抗体阳性率最高,母鸡阳性率为40.48%,公鸡阳性率为16.54%;126系次之,母鸡阳性率为28.87%,公鸡阳性率为3.30%;171系抗体阳性率最低,其母鸡阳性率仅为4.08%,公鸡的感染率为0。为了解地方鸡群中ALV-J的遗传变异,对分离到的5株ALV-J的GP85基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明,5个分离毒株的GP85基因大小均为924 bp,与预期一致;本研究样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%~98.5%,与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%~97.0%,与国内其他分离株的同源性为86.5%~99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性最高。结果表明:浙江省大部分地方品种鸡都不同程度感染ALV-J,而且分离毒株已经发生了不同程度的变异,提示我们应加强浙江省地方品种鸡ALV的净化工作。     

鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

鹅星状病毒(goose astroviruses, GAstV)作为一种雏鹅新发病原，对养鹅业造成巨大经济损失，在尚无有效治疗手段情况下，加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法，本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列，设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针，建立了一种双重荧光定量PCR检测方法，以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示，GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^-1;重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明，本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断，也可用于两种基因型GAstV的定量分析。     

基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原，辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗，经一系列试验，确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1，血清的最佳稀释度为1∶100，血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST，兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明，阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体；与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应；批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%；100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好，可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。     

不同鸭坦布苏病毒病疫苗免疫效果的比较

本研究选取鸭坦布苏病毒病弱毒疫苗(ZJ407-168株、WF100株)、灭活疫苗(ZJ407株、HB株)共4种疫苗,在实验室和鸭场对不同日龄的鸭进行免疫试验,并用间接ELISA法检测免疫后不同时期的抗体。抗体检测结果发现:弱毒疫苗免疫组在免疫后2周抗体阳性率就可达到100%,而灭活疫苗免疫组在免疫后4周抗体阳性率才达90%以上。但灭活疫苗免疫组抗体持续时间长,免疫后6个月抗体阳性率还能维持在90%以上,弱毒疫苗免疫组免疫后3个月抗体阳性率已下降至60%~70%。此外,灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值离散差异小,而弱毒疫苗免疫组检测到的抗体D值参差不齐。本研究的结果表明,弱毒疫苗免疫组产生抗体比灭活疫苗免疫组要早14 d,但灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值整齐,持续时间较长。上述结果可为临床防疫根据不同疫苗产生抗体的特点,合理使用疫苗,制定有效的免疫程序提供依据。