转MvNHX1和MvP5CS基因棉花耐盐抗旱性比较与育种价值分析

通过对花粉管通道法获得的T7转MvNHX1基因的10个棉花株系和转MvP5CS基因的3个棉花株系与对照非转基因棉花D5在温室内盐和干旱胁迫下的发芽率、生理生化指标以及田间花期干旱胁迫下农艺性状和纤维品质进行分析发现:温室内盐和干旱胁迫后,转基因棉花叶片叶绿素含量、脯氨酸含量均高于对照,而丙二醛含量低于对照;田间花期干旱胁迫下,2种转基因植株果枝数、有效果枝数、铃数、有效铃数、铃重、子棉、皮棉、衣分、子指和衣指均高于对照,说明转MvNHX1基因和转MvP5CS基因植株在干旱逆境下的产量高于非转基因;经花期干旱胁迫后,2种转基因棉花的纤维断裂伸长率、短纤维率、马克隆值和纺纱一致性指数优于非转基因棉花D5。综合分析表明:2种转基因棉花的耐盐抗旱性均有提高,其中转MvNHX1基因棉花的耐盐性优于转MvP5CS基因棉花植株,而转MvP5CS基因棉花植株的抗旱性优于转MvNHX1基因棉花植株。     

新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

为了进一步研究新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子的功能,采用双酶切的方法,用核酸内切酶SacⅠ和NcoⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒pEASY-T1-simple-pMvNHX1,然后回收目的片段。通过T4DNA连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌DH5α,通过画板,卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PCR及双酶切鉴定该载体后,用冻融法将其导入农杆菌EHA105。结果表明,成功培养出含有抗逆相关基因MvNHX1启动子pMvNHX1∶GUS∶EHA105的菌落;成功构建出新的植物表达载体pMvNHX1∶GUS。     

新牧1号苜蓿两种抗逆相关启动子的功能分析

前期已成功克隆了新牧1号苜蓿MvP5CS与MvNHX1基因和二者的启动子序列。在此基础上,本试验分别构建了含有Mvp5cs和Mvnhx1启动子的调控GUS报告基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导法得到了含有Mvnhx1与Mvp5cs启动子的转基因烟草植株。PCR检测证明了两种启动子已稳定的整合到烟草基因组中;GUS组织染色证明两种启动子均具有启动基因表达的功能。通过测量GUS活性来探究两种不同的诱导型启动子在4种非生物胁迫下(干旱、盐、脱落酸、赤霉素)的表达活性。结果表明,1)Mvnhx1与Mvp5cs启动子均响应盐、脱落酸、赤霉素、干旱胁迫,与CaMV35S启动子相比,差异显著。2)Mvnhx1启动子在盐胁迫、脱落酸胁迫下所起诱导作用要优于Mvp5cs启动子。在48 h 100 mmol/L、150 mmol/L NaCl胁迫处理时,Mvnhx1启动子GUS活性分别是Mvp5cs启动子的2.03和3.23倍,差异显著。在25 μmol/L、 50 μmol/L ABA处理下,Mvnhx1启动子的活性整体高于另两种启动子,差异显著。3)Mvp5cs启动子在干旱胁迫、赤霉素胁迫所起诱导作用优于Mvnhx1启动子。干旱胁迫时,Mvp5cs启动子的GUS活性在36 h是同时间Mvnhx1启动子的2.22倍。70 μmol/L GA处理时,Mvp5cs启动子在36 h达到最大值,是同时间段Mvnhx1启动子的1.79倍。