泄浊解毒方通过miRNA-155-5p/JAK2/STAT3通路改善溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜炎症反应分析

目的 应用生物信息学方法分析溃疡性结肠炎（UC）活动期与缓解期之间差异表达的微小RNA（miRNAs）,筛选差异表达基因（DEGs）构建调控关系,推测泄浊解毒方治疗UC的作用机制,并通过动物实验进行验证。方法 从基因表达数据库（GEO）中获取UC患者结肠黏膜组织miRNAs数据集,运用GEO2R、Excel等工具筛选差异表达最显著的miRNAs作为研究对象,运用TargetScan、miRTarbase、miRDB及STRING、TRRUST、Matescape数据库筛选关键DEGs、预测下游转录因子（TF）、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析,选取关键信号通路进行动物实验验证。动物实验采用2.5%的葡聚糖硫酸钠（DSS）自由饮方式制备UC小鼠模型,泄浊解毒方及美沙拉嗪灌胃7 d,苏木素-伊红（HE）染色观察结肠黏膜炎性浸润情况,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测结肠组织中miR-155-5p mRNA表达量;免疫组化法及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织中细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）、磷酸化转录信号转导子及激活子3（p-STAT3）、磷酸化JAK激酶2（p-JAK2）、维甲酸受体相关孤儿受体-γt（ROR-γt）蛋白表达量;酶联免疫吸附测定法（ELLSA）检测血清中转换生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）表达量。结果 GEO数据库筛选出GSE48957数据集,从活动期与缓解期样本中筛选到miR-155-5p作为研究对象,筛选出131个DEGs,其GO/KEGG富集分析主要与miRNA转录的正调节、蛋白质磷酸化等生物学过程,干细胞信号通路、IL-17信号通路、辅助性T细胞17（Th17）细胞分化等信号通路密切相关。运用Matescape数据库筛选出关键DEGs 10个,其中SOCS1是miR-155-5p的关键DEGs之一,进一步筛选关键DEGs的TF发现,STAT3是SOCS1的主要TF之一。动物实验结果显示,泄浊解毒方能有效下调UC小鼠结肠组织中miR-155-5p mRNA和p-STAT3、p-JAK2、ROR-γt蛋白表达,上调SOCS1蛋白表达,下调UC小鼠血清中IL-17、IL-6表达,上调TGF-β、IL-10表达,提高抑炎因子水平,减轻炎症细胞浸润情况。结论 推测泄浊解毒方可能通过调控UC小鼠miR-155-5p表达干预SOCS1,抑制STAT3磷酸化,抑制CD4⁺T细胞分化为Th17细胞,降低促炎因子（IL-17、IL-6）升高抑炎因子（TGF-β、IL-10）的水平,进而缓解UC小鼠结肠黏膜炎症反应。     

基于miRNA-34a-5p/PI3K/Akt信号通路探讨泄浊解毒方预防小鼠结直肠腺瘤的作用机制

目的 通过生物信息学方法寻找并分析结直肠腺瘤（CRA）的关键微小RNA（miRNAs）,筛选差异表达基因（DEGs）构建调控关系,推测泄浊解毒方预防CRA的作用机制,并通过动物实验进行验证。方法 从基因表达谱数据库（GEO）获取CRA患者肠黏膜组织miRNAs数据集GSE50194,通过GEO2R、Excel筛选差异表达的miRNAs;运用TargetScan、miRTarbase、miRDB数据库对差异表达的miRNAs进行靶基因预测并取得交集;通过STRING数据库及Cytoscape软件筛选关键DEGs,并利用TRRUST数据库预测下游结合转录因子;通过Metascape数据库对交集mRNA进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析,通过DIANA TOOLS工具对关键miRNAs进行KEGG富集分析,选取关键信号通路进行动物实验验证。动物实验采用葡聚糖硫酸钠（DSS）饮用联合氧化偶氮甲烷（AOM）腹腔注射方法（10 mg·kg^-1）诱导CRA小鼠模型建立,同时给予泄浊解毒方（9.62、19.24、38.48 g·kg^-1）及阿司匹林（0.015 g·kg^-1）灌胃干预9周。苏木素-伊红（HE）染色法观察结直肠组织病理变化;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测腺瘤组织中miR-34a-5p mRNA表达量;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、磷酸化-Akt（p-Akt）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白表达水平;免疫组织化学法（IHC）检测细胞周期蛋白D1（CCND1）的表达;原位末端标记法（TUNEL）检测腺瘤组织细胞凋亡情况。结果 GEO数据库筛选出GSE50194数据集,从CRA与正常肠黏膜组织中筛选出miR-34a-5p作为研究对象,筛选出93个DEGs,其GO和KEGG富集分析发现主要与转录调控复合体、RNA聚合酶Ⅱ转录调控复合物、酶联受体蛋白信号通路、DNA结合转录激活因子活性等生物学过程,癌症途径、PI3K/Akt信号通路等密切相关,miR-34a-5p主要汇集在PI3K/Akt信号通路、细胞周期、结直肠癌等途径。通过Matescape数据库筛选出5个关键DEGs,其中Bcl-2、CCND1是miR-34a-5p的关键DEGs,进一步筛选关键DEGs的转录因子发现,E2F转录因子1（E2F1）、肿瘤蛋白P53（TP53）等是Bcl-2、CCND1的主要转录因子。动物实验结果显示,与模型组比较,泄浊解毒方可显著上调CRA小鼠结直肠组织中miR-34a-5p mRNA的水平（P<0.01）,泄浊解毒方中、高剂量组显著下调PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达（P<0.01）,显著下调CCND1的阳性表达率（P<0.01）,显著增加肠上皮细胞凋亡率（P<0.01）。结论 推测泄浊解毒方可能通过调控CRA小鼠miR-34a-5p/PI3K/Akt信号通路,抑制CRA小鼠肠上皮细胞异常增殖,促进上皮细胞的凋亡,发挥预防CRA的作用。     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠IL-10、TNF-α及NF-κB表达的影响

目的:观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及核因子-κB(NF-κB)表达的影响并探讨其作用机制。方法:2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠制备溃疡性结肠炎大鼠模型,实验设正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、中药泄浊解毒方小、大剂量组;观察大鼠结肠病理形态学改变(DAI评分及CMDI评分),采用放射免疫法测定细胞因子IL-10、TNF-α,运用免疫组化染色(SP法)检测NF-κBp65表达。结果:泄浊解毒方可明显降低大鼠结肠DAI及CMDI评分,减少NF-κBp65表达,增加IL-10含量,降低TNF-α的含量。结论:泄浊解毒方对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用,其作用机制可能与减少NF-κBp65表达,增加IL-10含量,降低TNF-α的含量有关。     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠TLR2及IL-8IL-1β影响的研究

目的：针对溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）病机组成＂泄浊升清、解毒祛瘀＂之泄浊解毒方,通过动物实验,观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠TLR2、IL-8及IL-1β的影响,探讨该方治疗UC可能的作用机制。方法：本研究采用三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic acid,TNBS）/乙醇联合造模法诱导大鼠溃疡性结肠炎动物模型,实验分为空白组（BG）、模型组（MG）、泄浊解毒方大剂量组（HG）、泄浊解毒方小剂量组（LG）、柳氮磺胺吡啶组（SG）5组。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测大鼠结肠组织TLR2mRNA的表达;免疫组化染色（SP法）检测TLR2蛋白的表达;放免法检测大鼠血清IL-8、IL-1β的含量。结果：泄浊解毒方可明显降低TLR2基因、蛋白水平的表达及IL-8、IL-1β的含量。结论：泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠有良好的治疗作用,其作用机制可能与降低大鼠TLR2的表达及IL-8、IL-1β的含量有关。     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠Toll样受体4/核因子-κB 信号通路的影响

目的:观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠Toll 样受体4/核因子-κB 信号通路的影响并探讨其作用机制.方法:实验设正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、泄浊解毒方小剂量组、泄浊解毒方大剂量组,除正常组外采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇混合溶液灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型,灌服相应药物后后观察各组大鼠结肠组织Toll 样受体4 及核因子-κB 表达.结果:泄浊解毒方各剂量组大鼠Toll 样受体4 及核因子-κB 表达均明显低于模型组;泄浊解毒方大剂量组Toll 样受体4 及核因子-κB 表达明显低于柳氮磺胺吡啶组.结论:泄浊解毒方对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用,其作用机制可能与调节Toll 样受体4/核因子-κB 信号通路有关.     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠Toll样受体4/核因子-κB信号通路的影响

目的:观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠Toll样受体4/核因子-κB信号通路的影响并探讨其作用机制。方法:实验设正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、泄浊解毒方小剂量组、泄浊解毒方大剂量组,除正常组外采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇混合溶液灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型,灌服相应药物后后观察各组大鼠结肠组织Toll样受体4及核因子-κB表达。结果:泄浊解毒方各剂量组大鼠Toll样受体4及核因子-κB表达均明显低于模型组;泄浊解毒方大剂量组Toll样受体4及核因子-κB表达明显低于柳氮磺胺吡啶组。结论:泄浊解毒方对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用,其作用机制可能与调节Toll样受体4/核因子-κB信号通路有关。     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜Toll样受体蛋白的影响

目的：观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎（uc）模型大鼠结肠黏膜ToU样受体（TLR）蛋白的影响。方法：采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）,乙醇混合溶液灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型。实验设正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组和泄浊解毒方小、大剂量组,分别处理与给药后,观察各组大鼠结肠组织TLR2、TLR4蛋白的表达。结果：与正常组比较,模型组大鼠TLR2、TLR4均显著升高;与模型组比较,泄浊解毒方各剂量组和柳氮磺胺吡啶组TLR2、TLR4明显降低：而泄浊解毒方大剂量组TLR2、TLR4蛋白表达,泄浊解毒方小剂量组TLR2蛋白表达亦明显低于柳氮磺胺吡啶组。结论：泄浊解毒方对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用,其作用机制可能与调节rr0U样受体蛋白有关。     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-1β、IL-10及结肠黏膜CD14的影响

目的:通过动物实验证实泄浊解毒方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠治疗有效,并探讨其可能作用机制。方法:将40只实验大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、柳氮磺吡啶组、中药高、低剂量组5组,除空白组外,其余4组均采用TNBS/乙醇联合造模法制造UC模型。分组灌胃治疗14 d后,分别检测大鼠血清IL-1β、IL-10、结肠黏膜CD14含量。结果:模型组较空白组IL-1β、CD14表达明显升高,IL-10表达明显下降,差异有显著性(P0.05);中药高、低剂量组、柳氮磺吡啶组较模型组IL-1β、CD14表达明显下降,IL-10表达明显升高,差异有显著性(P0.05);中药高剂量组较柳氮磺吡啶组、中药低剂量组IL-1β、CD14表达明显下降,IL-10表达明显升高,差异有显著性(P0.05)。结论:泄浊解毒方干预UC大鼠可降低血清IL-1β、升高血清IL-10、下调结肠黏膜CD14表达,这可能是其作用机制之一。     

Poly Ⅰ∶C对急性期溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜屏障的影响

目的 研究Poly Ⅰ∶C对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠肠道黏膜屏障调节作用.方法 30只小鼠随机分为正常对照组、模型组、Poly Ⅰ∶C组,建立急性溃疡性结肠炎动物模型;观察小鼠一般活动情况及结肠病理学变化、应用免疫组织化学荧光染色法测定结肠组织水闸蛋白(claudin-1)、闭锁小带(zo-1)蛋白表达的变化.结果 实验期间,Poly Ⅰ∶C干预治疗后模型小鼠的一般情况有明显改善;模型组小鼠结肠黏膜缺损,腺体破坏或消失,可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润;Poly Ⅰ∶C组可见炎性细胞浸润少,炎症程度较模型组明显减轻.与模型组比较,经过Poly Ⅰ∶C治疗后结肠组织黏膜中claudin-1、zo-1蛋白的荧光表达明显增强.结论 Poly Ⅰ∶C对急性溃疡性结肠炎模型小鼠肠道黏膜屏障有调节作用.     

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠TLR4、IκB-α及IL-8表达的影响

目的根据溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）病机组成＂泄浊升清,解毒祛瘀＂之泄浊解毒方,通过动物实验观察该复方对溃疡性结肠炎大鼠TLR4、IκB-α及IL-8的影响,探讨该方治疗UC的作用机制。方法将40只Wistar大鼠随机分为空白组（BG）、模型组（MG）、柳氮磺胺吡啶组（SG）、泄浊解毒方小剂量组（LG）、泄浊解毒方大剂量组（HG）5组,每组8只;除BG外,其余各组采用三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic acid,TNBS）/乙醇联合造模法复制大鼠结肠炎模型;造模后第4天,BG、MG每天予0.9%NaCl溶液10ml/kg灌胃,SG给予柳氮磺胺吡啶液0.3g/kg灌胃,LG、HG分别给予泄浊解毒方水煎剂10.0g/kg、泄浊解毒方水煎剂20.0g/kg,各组均连续干预2周。以免疫组化技术检测大鼠结肠组织TLR4、IκB-α蛋白水平的表达,放免法检测大鼠血清IL-8的含量。结果与BG比较,MG大鼠的TLR4、IκB-α蛋白水平及血清IL-8含量明显升高,差异有统计学意义（P〈0.01）;与MG比较,SG、LG、HG大鼠的TLR4、IκB-α蛋白水平及血清IL-8含量明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）;与SG及LG比较,HG大鼠的TLR4、IκB-α蛋白水平及血清IL-8含量明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。结论泄浊解毒方可降低溃疡性结肠炎大鼠TLR4、IκB-α的表达及IL-8的含量。