UCLA的PBL教学对《药理学》课堂教学的启示

笔者在自己的实践教学中,将加州大学洛杉矶分校(University of California,Los Angeles,UCLA)以问题为基础的学习(Problem-based learning,PBL)的先进教学方法融入到教学中.在线下教学中,将PBL中的发散思维应用在医学机能学实验中,在药理学传出神经系统概述章节的学习中,将PBL中的回应社会热点事件运用于教学实践中;线上教学中,在药物代谢动力学章节,针对新冠肺炎的热门候选药物磷酸氯喹设计问题,并利用问卷星对学生做了新冠肺炎的PBL教学的问卷调查.取得了比较满意的教学效果.使学生学到了书本上学不到的知识.     

MBP不同cDNA序列真核表达载体的构建及鉴定

目的以pEGFP-N1质粒载体为介导,构建针对髓鞘碱性蛋白(MBP)不同isoform cDNA的表达载体。方法将三段不同MBPcDNA序列克隆入pEGFP-N1质粒,转化DH5α感受态细胞,酶切鉴定及测序。结果测序结果显示插入的三段目的片段的序列与理论序列一致。结论笔者成功构建了pEGFP-N1-MBP21.5,pEGFP-N1-MBP18.5和pEGFP-N1-MBP17.3三个重组真核表达载体,为进一步研究不同MBP cDNA在真核细胞中的表达情况和功能差异奠定基础。     

小鼠高迁移率族蛋白B1启动子的构建与转录活性检测

【目的】构建小鼠高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子全长序列的荧光素酶报告基因用于药物筛选。【方法】采用PCR技术扩增小鼠HMGB1基因启动子全长序列,用GV238载体构建报告质粒GV238-HMGB1-P-Luc,以pGL3-basic作为阴性对照质粒,与内参质粒pRL共转染Hela细胞,以内毒素(LPS,0.2μg/mL)作为激活剂,以正丁酸钠(SB,10 mmol/L)作为抑制剂,分组处理24 h后检测荧光素酶活性。【结果】经酶切、PCR及测序鉴定证实克隆的HMGB1基因启动子全长2 140 bp,DNA序列正确无突变。与pGL3-basic组比较,GV238-HMGB1-P-Luc组荧光素酶活性显著增强(P0.05);与GV238-HMGB1-P-Luc组比较,LPS组荧光素酶活性显著增强(P0.01);与LPS组比较,SB组荧光素酶活性显著降低(P0.01)。【结论】HMGB1基因启动子报告基因构建成功,LPS可以增强其表达,SB则可以抑制LPS刺激下的HMGB1启动子表达增强,可为下一步筛选具有调控HMGB1启动子活性的药物奠定基础。     

小鼠原代血管平滑肌细胞改良分离方法的建立

目的：建立方便、快速、高效的小鼠原代血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）的分离培养方法,为相关研究提供快速获取原代VSMC的方法技术。方法：分离小鼠主动脉,用I型胶原酶消化血管组织去除内皮细胞等杂细胞;将血管切成1mm。大小组织块种植于六孔细胞培养板孔底,用分离培养液诱导原代VSMC细胞的繁殖生长。光学显微镜观察细胞形态特征;免疫组化方法鉴定VSMC特异性蛋白α-SMA的表达;RT—PCR方法检测VSMC特异性蛋白α-SMA和SM22α的mRNA表达水平。结果：本方法分离原代VSMC,3d后可见长梭状VSMC从组织块边缘长出,7d后可以进行传代。光学显微镜观察显示,分离细胞具有平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）形态特征;免疫组化分析显示,分离细胞α—SMA蛋白表达阳性;RT—PCR分析显示,分离细胞中α-SMA和SM22α在mRNA水平高表达。结论：本实验成功建立了一种简便、快捷、高效从组织块分离培养VSMC的改良方法,为快速获得原代VSMC提供了一种适用的方法技术。     

21.5kD MBP RNAi有效靶点的筛选及验证

目的:构建21.5 kD MBP基因干扰序列21.5 kD MBP-shRNA(21.5 kD MBP short hairpin RNA interference),筛选最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究提供实验材料。方法:将21.5 kD MBP-shRNA阳性真核表达载体和阴性真核表达载体经脂质体介导分别转入人神经胶质瘤细胞株U251中,观察转染24 h后的转染效率;提取各组细胞总RNA,用实时荧光定量PCR技术检测各组21.5 kD MBP基因在mRNA水平的表达差异性。结果:21.5kD MBP-shRNA真核表达重组载体被成功转染入U251细胞,与阴性对照质粒(pGenesil-1-MBP-neg)转染组相比,沉默质粒转染组(pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3质粒分别转染)细胞中21.5 kD MBP mRNA表过水平均显著下降(P<0.05),其中pGenesil-1-MBP-3转染组细胞中21.5 kD MBP mRNA表达水平最低。结论:成功筛选出最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究及基因治疗研究奠定了实验基础。     

新式手套式毛巾在床上擦浴中的应用

目的了解新式手套式毛巾在床上擦浴中的应用效果及优点。方法选取40例需要床上擦浴的患者,分别应用传统式小毛巾和新式手套式毛巾擦浴,通过自身前后对照,比较两种毛巾在床上擦浴中的优缺性。结果采用新式手套式毛巾擦浴的擦浴时间、皮肤清洁度、舒适度及患者满意度分别为（22．15±1．95）min,（2．77±0．44）分,（2．69±0．48）分,（2．77±0．44）分,均优于传统式小毛巾擦浴,差异有统计学意义（t值分别为17．57,-6．25,-6．06,-9．66;P〈0．01）。结论新式手套式毛巾使用便捷,值得临床推广。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂S25的代谢稳定性和表型研究

目的:探讨抗癌药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂S25在不同种属中代谢稳定性差异并确定S25药物的代谢表型。方法:将S25置于人、小鼠、大鼠、犬和猴的肝微粒体中孵育,运用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)方法检测经过孵育代谢后S25剩余浓度,分析其代谢稳定性并推导出其在体内的半衰期及清除率;通过肝微粒体中细胞色素P450酶(CYP450)同工酶特异性抑制剂的化学抑制剂方法鉴定S25在小鼠肝微粒体中的代谢表型。结果:S25在人、小鼠、大鼠、犬和猴5个种属肝微粒体中半衰期(t1/2)分别为45.00、187.30、43.31、130.75、198.00 min;肝微粒体中固有清除率CLint分别为30.8、7.4、32、10.6、7/m L·min-1·mg-1;在人肝微粒体中S25主要通过CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19催化代谢。结论:在肝微粒体研究体系中,S25通过多种酶催化而迅速代谢降解;该药在人和小鼠的代谢动力学无差异,小鼠肝微粒体代谢系统可用于S25在人体内发生不良反应的风险评估。     

载脂蛋白C-Ⅲ基因沉默对HepG2细胞脂代谢的影响

目的:研究RNAi技术沉默载脂蛋白C-Ⅲ基因(ApoC3)表达后对HepG2细胞内外脂质含量及其他脂代谢相关基因表达的影响。方法:合成3对针对ApoC3mRNA不同位点序列的小干扰RNA(siRNA),并分组转染至人肝细胞株HepG2,实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法检测ApoC3mRNA及蛋白质的表达水平,筛选出沉默效果最佳的一对siRNA。将最有效的siRNA转染HepG2细胞,48h后测定细胞内外脂质含量以及脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果:25nmol/L siRNA和3μl/孔(24孔板)转染试剂的转染效率最高。ApoC3-siRNA-3对ApoC3基因的沉默效果最好,对mRNA的抑制率为94.6%,上清液中检测不到ApoC-Ⅲ。ApoC3-siRNA-3沉默ApoC3基因后细胞内三酰甘油(TG)和胆固醇含量显著高于对照组,细胞外TG含量显著低于对照组。与对照组比较,ApoC3-siRNA-3沉默组载脂蛋白B100基因mRNA表达水平显著增强,肝脂酶基因mRNA表达水平显著降低。结论:ApoC3基因沉默可显著升高HepG2细胞内TG含量及显著降低细胞外TG含量,其可能机制是通过减少极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒的分泌以及增加VLDL残粒的摄取。     

新冠肺炎期间大学生在线教学的探索

目的:新冠疫情期间,线上教学成为主流的教学模式,本人在教学方法进行积极探索,希望为药理学在线教育提供可借鉴的经验与模式。方法:使用超星学习通软件、建班级QQ群,搭建在线学习平台,对我校本科生实施在线教学。并针对教学环节如讲课方式的选择、学习效率高低、预习及作业完成情况使用问卷星设计问卷,根据反馈的数据改进教学。结果:总共有99.1%希望任课老师能直接参与到在线教学当中,有33.5%的学生认为老师与学生互动较少,有53.8%的学生能独立完成作业。想预习,不知如何预习占54.8%。     

尿酸性肾病大鼠模型建立的研究

目的 建立合理、稳定的尿酸性肾病大鼠模型,为筛选及研究治疗尿酸性肾病提供病理模型.方法 实验大鼠随机分为3个造模组和正常组.造模组分别予以750 mg/kg氧嗪酸钾联合150 mg/kg低剂量尿酸(M-A组)、750 mg/kg氧嗪酸钾联合300 mg/kg中剂量尿酸(M-B组)、750 mg/kg氧嗪酸钾联合600 ...