检测鹿新孢子虫感染的双抗夹心Dot-ELISA方法的建立及其应用

目的建立检测鹿新孢子虫感染的双抗夹心Dot-ELISA方法,并进行初步应用。方法以双抗夹心ELISA方法的A490值对应Dot-ELISA方法显色结果的方式,建立双抗夹心Dot-ELISA方法检测结果判定标准,确定HRP标记的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体1H11、包被抗体(抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体1A1)、待测血清的最佳工作浓度,并对该方法的特异性、重复性及灵敏度进行验证。用建立的方法检测79份鹿血清,并与双抗夹心ELISA方法进行比较。结果确定该方法 HRP-H11抗体的最佳稀释度为1∶100,包被抗体最适工作浓度为0.3μg/片,待测血清稀释度为1∶8。自然感染犬新孢子虫的鹿阳性血清的敏感性稀释度为1∶64,与弓形虫阳性血清无交叉反应,敏感性、特异性较强;自然感染新孢子虫的鹿阳性血清3次检测结果重复性较好。该方法检测的76份鹿血清中,阳性12份,阳性率为15.2%,与双抗夹心ELISA方法检测结果一致。结论建立的双抗夹心Dot-ELISA方法可用于检测鹿群感染新孢子虫循环抗原,为新孢子虫病的诊断提供了新的方法。     

旋毛虫感染诱导的小鼠乳腺癌MCF-7细胞基因表达的变化

目的构建旋毛虫感染诱导的小鼠乳腺癌MCF-7细胞基因表达变化的cDNA消减文库,探讨旋毛虫感染诱导的MCF-7细胞基因表达的变化。方法复制MCF-7细胞小鼠模型,设对照组和旋毛虫感染组(实验组),采用抑制性消减杂交技术构建旋毛虫感染诱导的MCF-7细胞上调基因表达消减文库,并利用反向Northernblot技术对所获得基因的特异性表达进行验证。结果成功构建了旋毛虫感染诱导的MCF-7细胞上调基因表达消减文库,克隆的目的基因片段大小分布在200～500bp之间,20个阳性克隆的测序结果经BLAST比对,获得差异表达的已知功能基因8个和未知功能基因4个,这些基因在小鼠乳腺癌细胞中均有表达,而在肌肉组织中无表达。结论旋毛虫感染诱导的MCF-7细胞差异表达基因上调,其中RB基因可能与乳腺癌细胞的生长抑制密切相关,为在基因水平研究旋毛虫抗肿瘤机理奠定了基础。     

旋毛虫对BALB/c小鼠体内人结肠癌HCT-8细胞的作用

目的观察旋毛虫感染对BALB/c小鼠体内人结肠癌HCT-8细胞生长的作用。方法用不同剂量的旋毛虫感染BALB/c小鼠,并在不同时间接种HCT-8细胞,荷瘤20 d后解剖小鼠,测定小鼠体内肿瘤的体积、重量,计算抑瘤率,并检测T淋巴细胞亚群。结果各实验组小鼠肿瘤体积和重量均显著低于对照组,CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、未长瘤小鼠比例、小鼠死亡率和抑瘤率均显著高于对照组;先接虫后荷瘤组抑瘤效果优于先荷瘤后接虫组。结论旋毛虫对BALB/c小鼠体内的人结肠癌HCT-8细胞的生长有一定的抑制作用。     

贾第虫核糖核酸酶PRNA转录本3′端序列及其存在形式

目的确定贾第虫滋养体内核糖核酸酶P(RNase P)RNA 3′端序列及其存在形式。方法提取贾第虫滋养体总RNA,大肠埃希菌(E.coli)Poly(A)聚合酶加polyA尾后,进行反转录,扩增出加polyA尾后的cDNA,经PCR及测序进行鉴定,确定其3′端序列。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测RNase P-GLsR15共转录体与RNase PRNA成熟体的总表达量,两者之差即为RNase P RNA成熟体的表达量,确定贾第虫RNase P RNA的存在形式。结果 RNase P RNA 3′cDNA大小约300 nt,3′端序列与GLsR15 3′端序列一致;RNase P-GLsR15共转录体和RNaseP RNA成熟体的总表达量与RNase P-GLsR15共转录体表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论已成功克隆了RNase P RNA 3′端序列,证实RNase P RNA和GlsR15的共转录体即为RNase P RNA成熟体的存在形式。     

旋毛虫iRNA对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的抑制作用

目的观察旋毛虫免疫核糖核酸(iRNA)对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的抑制作用。方法以不同剂量旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫ICR小鼠、家兔和山羊,ELISA检测抗体效价达1:1024的最低免疫剂量确定为最佳免疫剂量,同时取各实验动物肝、脾和淋巴结,制备旋毛虫iRNA,并进行鉴定。以不同剂量iRNA接种BALB/c小鼠,并在不同时间接种SP2/0肿瘤细胞(试验分为先荷瘤和后荷瘤进行)。在荷瘤20d时,处死小鼠,测量肿瘤体积和重量,并检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。结果旋毛虫肌幼虫可溶性抗原的最佳免疫剂量分别为:ICR小鼠:300μg/只;家兔:2mg/只;山羊:20mg/只。制备的旋毛虫iRNA各项指标均合格。各试验组小鼠肿瘤体积和重量均小于相应的对照组,且差异均有统计学意义;各试验组小鼠的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值较相应的对照组均有不同程度的增高。在后荷瘤试验组中,1mg组抑瘤效果最好;在先荷瘤试验组中,4mg组抑瘤效果最好。结论旋毛虫iRNA对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长具有较强的抑制作用。     

RNA干扰PTEN基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的:观察小干扰RNA(siRNA)对结肠癌相关基因PTEN表达的抑制作用及其对结肠癌细胞增殖能力的影响.方法:构建携带有针对PTEN基因序列的siRNA真核绿色荧光表达载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4,脂质体法转染入结肠癌HCT-8细胞(分别为p1、p2、p3和p4组),同时设转染阴性对照质粒组(p5组)和亲本细胞组(p6组),实时 PCR方法检测PTEN mRNA表达,MTT法分析细胞增殖活性变化.结果:通过荧光显微镜观察计数,细胞转染率为58%.实时 PCR方法检测结果显示,siRNA 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4的抑制率分别为48.3%、76.5%、29.4%和61.2%,与p6组比较差异均有统计学意义(P<0.05).MTT结果表明,细胞增殖抑制能力明显增强.结论:PTEN基因在肿瘤的发生发展中可能起到一定的作用.     

苏木精染色对冰冻切片组织RNA及蛋白质浓度和质量的影响

目的探讨苏木精染色对冰冻切片组织RNA及蛋白质浓度和质量的影响。方法将10份乳腺癌组织冰冻切片进行苏木精染色以及苏木精染色后酸洗处理,利用显微切割技术从冰冻切片中获取特定乳腺癌细胞,Trizol提取相应的RNA及总蛋白,琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR分析RNA质量,SDS-PAGE和Bandscan软件分析蛋白质电泳结果,并进行RNA和蛋白质的浓度测定。结果从10份乳腺癌组织冰冻切片中提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测,苏木精染色组和苏木精染色后酸洗组的28S、18S、5S条带均有不同程度的降解,RT-PCR结果显示,RNA完整性较好;提取的蛋白电泳图谱处理前后无明显差异;苏木精染色以及苏木精染色后酸洗处理对乳腺癌组织中的RNA及蛋白质浓度无显著影响。结论苏木精染色对乳腺癌冰冻切片组织中RNA及蛋白质浓度和质量无显著影响,为肿瘤蛋白质组学的进一步研究提供了理论支持。     

Kozak序列对TIMP1基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响

目的探讨Kozak序列对基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响。方法构建pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K(含有Kozak序列)重组真核表达质粒,用FugeneHD转染试剂将重组表达质粒转染MCF-7细胞,采用荧光定量PCR和Western blot检测pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K在MCF-7细胞中表达的差异。结果重组真核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。质粒pcDNA3.1-TIMP1-K转染细胞比空白对照细胞TIMP1基因mRNA表达量高约0.95倍,蛋白表达量高0.43倍;而质粒pcDNA3.1-TIMP1转染细胞比空白对照细胞mRNA表达量高0.37倍,蛋白表达量高0.25倍。结论质粒pcDNA3.1-TIMP1-K与pcDNA3.1-TIMP1在MCF-7细胞中mRNA和蛋白表达水平均存在差异,Kozak序列提高了TIMP1基因的表达。     

弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)基因。方法收集、纯化Rh株弓形虫速殖子,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgCyP基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-TgCyP,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TgCyP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的相对分子质量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的40%,Western blot显示其能被鼠抗弓形虫免疫血清识别。结论已在E.coliBL21(DE3)中表达了Rh株TgCyP,其有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

Ni/Al微叠层复合板的成形性能

采用真空热压法制备了Ni/Al微叠层复合板。通过不同温度、不同变形量下的单向拉伸实验研究了Ni/Al微叠层复合板的力学性能与裂纹萌生扩展规律。结果表明，Ni/Al微叠层复合板在室温至400℃塑性较差，变形量仅为5%时，NiAl3和Ni2Al3金属间化合物层便已产生较多垂直于拉伸方向的裂纹。Ni/Al微叠层复合板600℃表现出良好的塑性变形能力，断裂延伸率高达56%，且变形量达到20%时NiAl3层才开始出现微裂纹，变形量达到50%时裂纹仍未扩展至Ni2Al3层及Al层。采用气压自由胀形实验研究了Ni/Al微叠层复合板600℃条件下的成形性能，并对胀形件微观组织分布进行了表征。结果表明，Ni/Al微叠层复合板600℃/5.5MPa/8min条件下，极限胀形率(极限胀形高度/凹模直径)达36.7%。胀形球壳由底部至顶部壁厚逐渐减小，顶部Ni、Al层颈缩严重，NiAl3层产生裂纹，但并未扩展至Ni2Al3层及Al层。