牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究

基于对RNA二级结构的预测和密码子偏性计算,通过计算机辅助软件进行牛IFN-α基因优化,经人工合成优化后的基因与pWL表达载体连接后诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,其产物分子量约为17ku,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的33％,表达产物以包涵体形式存在。经过包涵体溶解、初步复性后利用CM Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用梯度法进行牛α-干扰素包涵体蛋白质的纯化复性。结果表明,梯度离子交换层析法能有效地复性牛α-干扰素包涵体,复性后的重组牛α-干扰素的纯度达95％,通过离子交换层析柱纯化和复性后,重组牛α-干扰素在MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性为5．56×10^6 u／mg。     

东北白鹅CD4基因的克隆及其胞外区的表达与抗血清的制备

本研究根据GenBank公布的绿头鸭CD4(AF378701)基因序列设计引物,RT-PCR获得东北白鹅CD4基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD4胞外区基因,并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗鹅CD4胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot和流式细胞仪分析表明抗血清可特异识别重组蛋白以及分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞,间接免疫荧光试验证实纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD4胞外区蛋白。以上结果说明制备的抗血清可作为鹅CD4+T淋巴细胞的检测试剂。     

在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬0干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein (SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒.重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白.重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础.